1、Confocal黄娅林复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室Confocal共聚焦激光扫描显微镜技术Confocal Confocal 技术基本情况介绍 Confocal 工作原理和性能特点 Confocal 样品制作和系统操作 Confocal 技术在科研中的作用Confocal共聚焦激光扫描显微镜Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM, Confocal)共聚焦激光扫描显微镜在传统荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用紫外或可见激光激发荧光探针，对生物样品进行断层扫描，结合计算机对荧光图像进行加工处理观察细胞和组织内部各个层面或不同
2、侧面的形态变化 。 基本情况介绍Confocal特殊结构分辨率提高30%-40%产生真正意义的三维图像观察活细胞的动态变化细胞内离子的动态测量 基本情况介绍Confocal激光器扫描装置荧光显微镜 直立或倒置探测器 PMT计算机 系统控制软件各种应用软件图像储存和输出设备系统构成 基本情况介绍ConfocalLeica TCS-NT (1997.6)Leica CLSM(1994.5）Leica TCS-SP2 (2004.9)仪器简介 基本情况介绍医学神经生物学国家重点实验室（医学院路138号治道楼801）ConfocalLeica TCS-SP25(2007.12)仪器简介 基本情况介绍生
3、物医学研究院干细胞研究所（东安路130号西13号楼410）ConfocalLeica CLSM显微镜激光器 基本情况介绍Confocal显微镜 DM RBC 直立显微镜Objective type Magnification Numeral Technique Workingaperture distance(mm)PL FLUOTAR 5x 0.12 13.1PL FLUOTAR 10x 0.30 4.9PL FLUOTAR 16x 0.50 IMM * 0.15PL APO 50x 0.75 W * 0.12N PLAN 100x 1.20-0.45 W 0.07* IMM=either
4、water, glycerine or oil * W =water激光器 Argon (488，514nm) He/Ne 543nmHe/Ne 633nm 基本情况介绍Leica TCS-NTConfocal 基本情况介绍Leica TCS-NTConfocal显微镜 DM IRE2 倒直显微镜Objective type Magnification Numeral Technique aperture HC PL FLUOTAR 5x 0.15 HC PL APO CS 10x 0.4 HC PL APO CS 20x 0.7 IMM *HCX PL APO CS 40x 1.25 OIL
5、 HCX PL APO CS 63x 1.4 OILHCX PL APO CS 100x 1.4 OIL * IMM=glycerin or oil 激光器 Argon (488，514nm) He/Ne 543nmHe/Ne 633nm双光子 780-900nm(DAPI、Hoechst、BFP、CFP) 基本情况介绍Leica TCS-SP2Confocal 基本情况介绍Leica TCS-SP2Confocal激光器 405nm LaserArgon (458nm，476nm，488nm，514nm) He/Ne 561nm He/Ne 633nm 基本情况介绍Leica TCS-SP5
6、显微镜 DMI6000 倒直显微镜Objective type Magnification Numeral Technique aperture HC PL APO CS 10x 0.4 DRYHCX PL FLUOTAR 20x 0.4 DRY HCX PL APO 20x 0.7 IMM *HCX PL APO 40x 1.25 OIL HCX PL APO 63x 1.4 OIL* IMM=glycerin or oil Confocal 基本情况介绍Leica TCS-SP5ConfocalLaserPinhole激光束经照明针孔反射至物镜，在样品的某一焦平面形成一个点，并进行扫描。聚
7、焦平面内各个像素点的荧光强度经探测针孔后由光电倍增管收集放大，迅速形成高清晰度的荧光图像。照明针孔和探测针孔的共轭 显微镜的步进马达装置 工作原理ConfocalPinhole与图像的关系 工作原理Confocal一. 横向分辨率比普通荧光显微镜高 1.4倍用抗Tubulin 抗体染色的 Astrocyte：非共焦（左）及共焦（右）图像并列显示 性能特点Confocal样品厚度可达500m深度分辨率为0.1m扫描模式：xy：观察样品不同层面的荧光强度变化xz：观察样品沿Z轴的荧光强度变化 性能特点二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力Confocal扫描模式 决定了图像的扫描层次。基本上是扫
8、描水平的xy-切片或垂直的xz-切片。为建立样品的三维图像，需要在第三维方向上进行连续的光学切片以产生图像垛。还可以以时间或波长为第三维坐标进行图像扫描。扫描模式 功能xyz 在Z轴方向上进行连续的xy-切片xzy 在y轴方向上进行连续的xz-切片xt 连续进行多次线扫描xyt 对xy-切片进行连续多次扫描xzt 对xz-切片进行连续多次扫描xyzt 以xyz扫描方式对图像垛进行连续多次扫描xy 在不同的波长下扫描xy切片xz 在不同的波长下扫描xz切片xyt 在不同的波长下对xy切片进行连续多次扫描xyz 在不同的波长下对xyz图像垛进行扫描 性能特点二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力
9、ConfocalA Series of Image of xy-sectionCultured gliocyte of rat brain stained by Fluorescin.二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力 性能特点Confocal二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力 性能特点Confocal探测低对比度或弱荧光信号通过目镜可直接观察各种生物样品的弱自发荧光三. 采用激光照明 性能特点Confocal四. 四. 观察活组织和活细胞的动态变化 性能特点ConfocalDrosophila mitosispre-cellularized embryoGFP-tagged hi
10、stone,Tubulin: rhodamine四. 观察活组织和活细胞的动态变化 性能特点Confocal利用激光扫描技术，借以特定的荧光探针，快速、准确地测定细胞内各种离子含量，包括Ca+、Mg+、Na+、K+、H+以及pH值等。细胞内游离钙测定细胞内Ca2+稳态的维持对生命活动是至关重要的，病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，致细胞坏死和凋亡，测定细胞内钙在生理、病理和药理学上均具有重要意义。五. 细胞内各种离子的动态测量和分析 性能特点ConfocalConfocal提供高分辨率二维图像和三维图像准确测定单个细胞内不同部位的Ca+含量实时动态观察Ca+含量变化钙敏荧光探针 激
11、发波长 发射波长-Quin-2 339 nm 492 nmIndo-1 350 nm 485 nmFura-2 380 nm 510 nmFluo-3 490 nm 525 nmCalcium Green 505 nm 530 nmCalcium Orange 505 nm 530 nm 五. 细胞内各种离子的动态测量和分析 性能特点Confocal五. 细胞内各种离子的动态测量和分析 性能特点ConfocalPhysiology Chart (Time: 10:15:21)0.0040.0080.00120.00160.00Int.200.00 400.00 600.00 800.00 sChannel 1Cultured hippocampal neurons of ratFluo-3(AM)五. 细胞内各种离子的动态测量和分析 性能特点ConfocalCa2+-imaging:UV-uncagingCa-Indicator: Fluo 4,488 nmPancreatic acinar cells五. 细胞内各种离子的动态测量和分析 性能特点ConfocalCardiomyocytesFluo-3Ca2+-sparks andCa2+-waves五. 细胞内各种离子的动态测量和分析 性能特点
