1、. .微生物工程教案授课教师：张爱梅西北师范大学生命科学学院2013年4月. .课程名称 微生物工程课程代码 74022718 学分 2 总学时 36 理论学时 36课程性质 基础课（ ） 专业必修课（ ） 专业限选课（） 专业任选课（ ）教学手段 多媒体任课教师 张爱梅 职称 副教授 授课时间 20122013 学年第一学期授课对象 2010 级生物技术 1 班教 学目的与要 求通过系统地讲授微生物工程的原理、方法、生产设备、应用及进展.使生物技术专业类的学生对微生物工程的最新成就、原理和生产方法等有较全面地了解.扩大学生眼界.使其能够更加适应市场经济的需要。通过本课程的学习使学生将理科的有
2、关知识与必要的工程技术有机的结合起来.使学生既能掌握比较专业的理论知识.又能掌握工程技术方面的基本计算和设计工艺流程的原理和方法。教 学基 本要 求掌握微生物工程的基本原理及规律.熟悉微生物工程生产的常用设备.使学生既学到比较专业的微生物学理论知识.又掌握工程技术方面的基本计算和设计工艺流程的原理和方法。教 材 曹军卫主编微生物工程 （第二版）主要参考资料微生物工程 (吴松刚） 科学出版社 2004微生物工程工艺原理 (姚汝华) 华南理工大学出版社 2005新编生物工艺学 （俞俊棠） 化学工业出版社 2003发酵工艺原理 （熊宗贵） 中国药科大学出版社 2000发酵工程与设备 （邱立友） 中国
3、农业出版社 2007现代生物工艺学 （储炬） 华东理工大学出版社 2008微生物发酵过程多尺度研究与优化 （张嗣良） 化学工业出版社 2003 Fermentation Microbiology and Biotechnology (E. M. T. El-Mansi, C. F. A. Bryce, Arnold L. Demain ) Taylor 功能性发酵制品: r-亚麻酸；冬虫夏草；蘑菇、灵芝多糖; 活性肽；红曲色素, 低聚异麦芽糖、果糖、半乳糖、木糖；海藻糖等等。八与国际先进水平的差距 1多数工厂规模小、效益低 2生产技术水平比较低3产品品种单一.结构不合理 4应用的深度和广度不够
4、 . .5技术装备和检测手段落后.自动化水平低 6综合利用和环境治理差 九、加入 WTO 对我国发酵行业的影响 1有利因素主要表现 我国加入 WTO 后.是世贸组织的一个成员.可以同等享受最惠国待遇国民待遇也是世贸组织的一个重要原则 加入世贸组织.对企业引进外资和先进技术和先进装备以及管理经验.加速企业改组改造.进行企业结构和产品结构调整.促进企业的进一步发展有利中国加入 WTO 后.关税进一步降低中国加入 WTO 后.发酵企业对原料的选择性范围宽了 2不利因素主要表现 ：对原料产区形成卖粮难 国外先进国家技术水平高.产品质量好、成本低.对国内同类产品冲击较大 我国研究力量薄弱.研究手段相对落
5、后.综合素质较差 3应对措施： 加快技术进步步伐.走创新之路.提高水平.降低成本 调整企业结构和产品结构 提高企业领导经营管理水平.加强产品质量管理和产品标准化工作 加强国内国际之间的技术交流和合作.引进入才、引进外资、引进先进技术和装备发挥各行业的优势和特点.摘出本企业有特色的产品.以提高竞争力 发酵工程的重大转折点二十世纪四十年代初.第二次世界大战爆发.青霉素的发现.迅速形成工业大规摸生产。1928 年由 Fleming 发现青霉素 1941 年美国和英国合作对青霉素进行生产研究表面培养：1 升扁瓶或锥形瓶.内装 200mL 麦麸培养基 40u/ml1943 年沉浸培养： 5m3 200u
6、/ml当今：100m3200m3 5-7 万 u/ml链霉素、金霉素、新霉索、红霉素大型发酵罐搅拌装置180M3 发酵罐车间发酵车间的空气过滤器现代生物技术分子生物学. .与发酵工程氨基酸发酵工业谷氨酸、赖氨酸核酸发酵工业肌苷酸、乌苷酸微生物变异株通过代谢调节代谢控制发酵技术切断支路代谢转折点: 酶的活力调控, 酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏) 解除菌体自身的反馈调节,特殊调节控制的利用,突变株的应用,前体、终产物、副产物等发酵工程产业化发展目前.全球发酵产品的年销售额在 400 亿美元左右.并以每年约 78的速率增长。我国发酵行业生产企业有 5000 多家.主要发酵产品的年产值高达 130
7、0 亿元。发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力21 世纪是生物技术世纪未来学家说：21 世纪是生物技术世纪；科学家预言： 21 世纪世界即将在生物技术上取得重大突破.新世纪之初.科学方面的主要将在生物学、遗传学和医学、新型生物材料、能源、环境保护上有所突破；经济学家则认为：21 世纪 20 年代.生物经济将由目前的形成阶段进入成长阶段.即工业生产与商业开发阶段。 1.3 发酵工程的生物学与工程学基础发酵工程的主要问题-过程优化与放大在已提供高产菌株的基础上.如何把这些高产菌种在培养过程中进一步考察它的生理生化特性.稳定或改进微生物反应工艺过程.这里要求对生物物性的动态有详尽的了解
8、.对生化反应做定量的和动力学方面的考察。发酵工程在生物技术产业发展中的地位21 世纪的工业生物技术产业.究竟是一个什么样的格局？作为工业生物技术核心的发酵工程.在已经开始的生物经济时代.是处于一种什么状态？能起何种作用？又面临那些课题？这是人们所关注的问题！1 .4 本课程的学习内容通过发酵工程的学习.将技术基础课和专业课与发酵工业的操作原理结合起来.了解发酵工业控制的特性及共性.并且熟悉发酵工业的工艺流程及常用术语.为今后从事生物工程的有关科研和生产打下良好的基础。. .第二章 菌种的来源及选育第一节 微生物的特性及工业微生物的要求一.微生物的特性二、发酵工业常用微生物的形态特征1.细菌（B
9、acterium) （1）形态（2）结构 （3）培养特征2.酵母（Yeast) （1）形态（2）结构典型结构:细胞壁；细胞膜；细胞核；液泡；线粒体；内质网；核糖体；微体；微丝；内含物3.霉菌形态4、微生物的特点体积小；种类多；分布广；繁殖快；便于培养；容易发生变异；在生产中不易受时间、季节、地区的限制 5、微生物与发酵发酵工程是以微生物的生命活动为中心的 微生物的生物学性状和发酵条件决定了其相应产物的生成工业上用的全部微生物都称为工业微生物.工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌 由于发酵工程本身的发展以及基因工程正在进入发酵过程.病毒、藻类等其它微生物也正在逐步地变为工业生产
10、菌。三工业化菌种的要求能够利用廉价的原料.简单的培养基.大量高效地合成产物有关合成产物的途径尽可能地简单.或者说菌种改造的可操作性要强遗传性能要相对稳定不易感染它种微生物或噬菌体产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）. .生产特性要符合工艺要求第二节 自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程二、采样时要注意的问题三、目的微生物富集的一些基本方法四、菌落的选出第三节 已工业化产品生产菌的介绍一、抗生素生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物三、食品酶制剂生产有关的微生物第四节 优良菌种选育一、自然选育二、诱变育种诱变育种的一般步骤 出发菌株 纯化、活化、前培养（
11、同步培养） 培养液 离心收集细胞、洗涤.制备均一的菌悬液（玻璃珠打散、过滤） 单细胞或单孢子悬液 活菌计数.诱变预备试验 诱变处理 活细胞计数.致死率计算 后培养（中间培养） 平板分离 变异率计算 初筛复筛 保藏及扩大试验诱变育种工作中应注意的问题1.安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用.因此在操作中应时刻注意安全问题：个人安全和. .环境安全。 个人安全：操作时注意防护.不同诱变剂要求不同防护方法.如-射线辐射防护要求较高.uv要求较低.而化学诱变剂则要求不与身体有关部位直接接触。 环境安全：所用物品要经解毒处理；液体经解毒或充分稀释才可以排放。2. 要养成良好的工作习惯：如仔细观察细微的形
12、态变化、要详实记录菌株的诱变史和诱变谱系。 3. 诱变育种技术要和其他育种手段相结合。 4. 诱变育种由于其筛选的盲目性.突变的不定向性.工作量十分大.因此要对整个工作进行合理的设计并结合新技术提高其工作效率。 第五节 营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型是一种生化突变株.它的出现是由基因突变引起的。遗传信息的载体是一系列为酶蛋白编码的核酸序列.如果核酸序列中的某碱基发生突变.由该基因所控制的酶合成受阻.该菌株也因此不能合成某种营养因子.使正常代谢失去平衡。在筛选营养缺陷型菌株中.与之有关的培养基有三类：完全培养基：Complete Medium （CM）含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株
13、生长所需营养物质的天然或半合成培养基。 基本培养基：Minimal Medium（MM）：不含生长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分合成培养基。 补充培养基：Supplemented Medium(SM)：补充了一种或数种生长因子.以满足某微生物的特定的营养缺陷型生长的培养基.其中的生长因子多是通过直接添加AA、碱基或维生素而提供。. .第三章 菌种保藏的原理和方法一原理使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态.才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥、寡营养和隔绝空气 二防止菌种衰退的方法控制传代次数选择合适的培养条件利用不同类型的细胞进行传代选择合适的
14、保藏方法三菌种保藏法斜面保藏法(传代培养保藏法 )是指将菌种接种于适宜的培养基中.最适条件下培养.待生长充分后.于 46进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 液体石蜡保藏法(矿物油保藏法 )是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上.最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡.使其覆盖整个斜面.再直立放置于低温（46）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。穿刺保藏法1%软琼脂小试管和螺口小管沙土管保藏法将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液.注入灭菌的沙土管中混合均匀.或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中.使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上.将管中水分抽干后熔封管口或置干
15、燥器中于 46或室温进行保存的一种菌种保藏方法。真空冷冻干燥保藏法将微生物冷冻.在减压下利用升华作用除去水分.使细胞的生理活动趋于停止.从而长期维持存活状态。液氮超低温保藏液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196的液态氮.或在-150的氮气中的长期保藏方法.它的原理是利用微生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。-20低温冷冻保藏. .将菌种保藏在-20冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。 四菌种保藏机构CCGMC: AS-1,2,3,4,IVACCC: ISFCICC: IFFICMCC: NICPBP,ID,IVCACC. .第四章 微生物的代谢调节与代谢工程第
16、一节 代谢调节的方式1.细胞透性的调节 细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌. 从而 影响到细胞内代谢的变化。 细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式. 由它控制着营养物质的吸收。2.代谢途径区域化 原核微生物细胞结构虽然简单. 但也划分出不同 的区域. 对于某一代谢途径有关的酶系则集中在某一区域. 以保证这一代谢途径的酶促反应顺利进行. 避免了其他途径的干扰。 例如呼吸的酶系集中在细胞质膜上；而 与蛋白质合成有关的酶系则位于核蛋白体上；分解大分子的水解酶. 在革兰氏阴性菌里是位于壁膜间隙中.而 革兰氏阳性菌则将这些水解酶类. 分泌于胞外。 在真核微生物细胞里. 各种酶系被
17、细胞器隔离分布。 如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上；蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上；DNA 合成的某些酶位于细胞核里。 细胞具有复 杂的结构使其代谢活动只能在特定的部位上进行. 即代谢活动是区域化的. 其实质是控制酶与底物接触. 使各个反应有序地进行。3.代谢流向的调控 微生物在不同 条件下可以通过控制各代谢途径中某个酶促反应的速率来控制代谢物的流向. 从而 保持机体代谢的平衡。它包括两种形式: 由一个关键酶控制的可逆反应 由两种酶控制的逆单向反应由一个关键酶控制的可逆反应: 同一个酶可以通过不同辅基(或辅酶)控制代谢物的流向。 例如. 谷氨酸脱氢酶以 NADP+为辅酶时. 主要是催化
18、谷氨酸的合成. 当以NAD+为辅酶时. 则催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通过不同 的辅基来控制代谢物的流向。由两种酶控制的逆单向反应: 逆单向反应是在生物体代谢的关键部位的某些反应.它是由两种各自不同的酶来催化的。即在一个“可逆”反应中.其中一种酶催化正反应.而另一种酶则催化逆反应。. .例如. 葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖是由己糖激酶催化的.而 其逆反应则是由 6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。6-磷酸果糖转化为 1. 6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的.逆反应则由 1. 6-二磷酸果糖酯酶催化。4.代谢速度的调控 在不 可逆反应中. 微生物通过调节酶的活性和酶量来控制代谢物的流量。 微生物在不
19、同 条件下能按照需要. 通过激活或抑制原有酶的活性或通过诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代谢速度. 使之高度经济有效地利用能量和原料进行生长繁殖。二、酶活性的调节1. 概念 酶活性调节是指 一定数量的酶. 通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。2. 酶活性调节的影响因素 底物和产物的性质和浓度 环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等) 其他酶的存在3 .酶活性调节的调节方式 激活已有酶的活性- 激活剂 抑制已有酶的活性- 抑制剂 4 .酶活性的调节机制 改变酶分子的活性来调节微生物代谢速度的办法称为酶活性的调节。其活性发生改变的酶称为调节酶（Regulatory enzym
20、e） 。调节酶也称关键酶.包括变构酶、同功酶和多功能酶.通常为变构酶.一般具有多个亚基.包括催化亚基和调节亚基。微生物体内代谢过程的各种生物化学反应.都是由各种酶来催化的。按各种酶在代谢调节中作用的不同.又可将酶分为：调节酶(常称关键酶.与代谢调节关系密切)：包括以下 3 种：1)变构酶：一般是具有多亚基四级结构的蛋白质。 2)同功酶：具有同一种酶的底物专一性.但分子结构不同的一类酶。3)多功能酶：能够催化两种以上不同反应的酶。静态酶：一般与代谢调节关系不大。 潜在酶：指酶原、非活性型或与抑制剂结合的酶。 （一）激活 激活：在激活剂的作用下. 使原来无活性的酶变成有活性. 或使原来活性低. .
21、的酶提高了活性的现象。 代谢调节的激活作用：主要是指 代谢物对酶的激活。 前体激活. 指 代谢途径中后面的酶促反应. 可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。 代谢中间产物的反馈激活. 指 代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用。（二）抑制 抑制：由于某些物质的存在.降低酶活性的现象。 反馈抑制：反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑制。1.无分支代谢途径的调节 通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活性有抑制作用。2.有分支代谢途径的调节 在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代谢途径中.调节方式较复 杂. 其共同 特点是每个分支途径的末端产
22、物控制分支点后的第一个酶.同 时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用. 分支代谢的反馈调节方式有多种: 酶的顺序反馈抑制同工酶的反馈抑制 协同反馈抑制 累积反馈抑制 超相加反馈抑制（1）酶的顺序反馈抑制 分支代谢途径中的两个末端产物. 不 能直接抑制途径中的第一个酶. 只有当两个末端产物都过量时. 才能对途径中的第一个酶有抑制作用。（2）同工酶的反馈抑制同功酶是指能催化同一生化反应. 但它们的结构稍 有不同. 可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。其特点是：途径中第一个反应被两个不同 的酶所催化. 一个酶被 Y 抑制. 另一个酶被 Z 抑制。只有当 Y 和 Z 同 时过量才能完全阻
23、止 A 转变为 B。（3）协同反馈抑制 在分支代谢系统中. 几种末端产物同 时都过量. 才对途径中的第一个酶具有抑制作用. 如果末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。（4）累积反馈抑制. . 在分支代谢途径中各种末端产物单独过量时. 它们各自能对途径中的第一个反应的酶仅产生较小的抑制作用。一种末端产物单独过量并不 影响其它末端产物的形成.只有当几种末端产物同 时过量时. 才对途径中的第一个酶产生较大的抑制。（5）超相加反馈抑制 超相加反馈抑制是一种既不同 于协同 反馈抑制又不同 于累积反馈抑制的作用。对一个分支代谢途径中. 几种末端产物单独过量时. 仅产生对共同 途径的第一个酶部分的
24、抑制。如果每种末端产物都过量时. 其抑制作用则超过各种末端产物单独过量时抑制的总和。5.酶活性调节的分子机制 解释酶活性调节机制的理论： 别构调节理论(其核心是酶分子构象的改变) 酶分子的化学修饰理论(其核心是酶分子结构的改变)。三、酶合成的调节 1.酶合成的诱导：促进酶的合成. 2.酶合成的阻遏：抑制酶的合成.包括：1)终产物阻遏。2)分解代谢物阻遏。1.酶合成的诱导1).诱导酶:当环境中存在诱导剂时才产生的酶。而这种环境物质促使微生物细胞中酶合成的现象称为酶的诱导。2).组成酶:(p26)-EMP2.酶合成诱导的机制 诱导机制: 操纵子学说可以较好的说明酶的诱导产生的机制. 操纵子指 一组
25、功能上相关的基因. 它们由启动基因、操纵基因和结构基因构成。3.酶合成的阻遏1). 末端代谢产物阻遏（End-product repression） 这是酶合成阻遏中的一种。它是指由于末端产物的过量积累而引起代谢途径中酶合成的阻遏.是一种反馈阻遏.末端代谢产物阻遏的特点是同时阻遏合成途径中所有酶的合成。对于分支代谢途径的末端代谢产物阻遏.每种末端产物只专一地阻遏合成它自身那条分支途径的酶.而分支点的酶则受所有分支途径末端产物的共同阻遏。这种几个终产物.共同协调阻. .遏某一个酶的生物合成称为多价阻遏（multivalent repression） 。对于直线式代谢途径.末端产物阻遏情况较为简单
26、。末端产物将引起代谢途径中各种酶的合成终止。末端代谢产物阻遏的机制可以用操纵子学说解释。如大肠杆菌色氨酸操纵子模型。2). 酶合成的分解代谢物阻遏（Catabolite repression） 所谓分解代谢阻遏.是当细胞中具有一优先利用的底物时.很多其他分解反应途径往往受到最容易利用的底物阻遏的现象。由于这种阻遏并不是优先利用底物及作用的结果.而是有底物分解过程中产生的中间代谢物引起的.所以称为分解代谢物阻遏。这种阻遏效应最早在 1942 年由 Monod 在研究大肠杆菌混合碳源生长时发现。经研究发现.在微生物的生长体系中.外加 CAMP（环腺苷酸）可解除分解代谢物阻遏.这表明分解代谢物阻遏的
27、实质是由于细胞内缺少 CAMP。分解代谢物阻遏作用是发生在转录水平上的.因而属于转录水平的调节。Monod 提出的乳糖操纵子模型可以较好地解释分解代谢物的阻遏机制。葡萄糖效应 又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳源.其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。如大肠埃希氏菌培养在含葡萄糖和乳糖的培养基上.在葡萄糖没有被利用完之前.乳糖操纵子就一直被阻遏.乳糖不能被利用.这是因为葡萄糖的分解物引起细胞内 cAMP（环腺苷酸）含量降低.启动子释放 cAMP-CAP 蛋白.RNA 聚合酶不能与乳糖的启动基因结合.以至转录不能发生.直到葡萄糖被利用完后.乳糖操纵子才
28、进行转录.形成利用乳糖的酶.这种现象称葡萄糖效应。 CAP： 降解物激活蛋白又叫分解代谢基因活化蛋白 catabolite activator protein.简称 CAP 。在分解代谢阻遏中调节基因的产物是降解物基因活化蛋白（CAP）.它能与 环腺苷酸（cAMP）结合而被活化.帮助 RNA 聚合酶与启动子结合.促进转录进行。 4.酶合成阻遏的机制四、能荷调节能荷:指细胞中 ATP,ADP,AMP 系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。能荷=(【ATP】+0.5 【ADP】) (【ATP】+ 【ADP】+ 【AMP】) 100能荷= 100 全部是 ATP能荷= 0 全部是 AMP能荷=
29、50 全部是 ADP(三)、次级代谢的调节. . 初级代谢对次级代谢的调节 碳代谢物的调节作用 氮代谢物的调节作用 磷酸盐的调节作用 次级代谢中的诱导作用及产物的反馈作用 次级代谢中细胞膜透性调节(四)、次级代谢物合成的特点 次级代谢物合成过程远较初级代谢产物复杂； 次级代谢产物则需要复 杂的营养条件； 在分批培养条件下. 次级代谢产物一般都是在菌体生长的峰值出现后才大量合成。 (五)、常用的提高次级代谢产物产量的方法 (1) 补加前体类似物 前体：指 某些化合物加入到发酵培养基中. 能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去.而 其自身的结构并没有多大变化. 但是产物的产量却因加入前
30、体而有较大的提高。 在合成途径已基本清楚的条件下. 向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的有效方法。 如青霉素 G 的生产中. 苯乙酰-CoA 是限速性因子. 补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素 G 的产量。 次级代谢产物形成中并不 是所有前体类似物都是限制性因子。加入前体提高产量的效果更取决于总体代谢的调节水平。前体物质本身是否易于得到等。这都是在生产应用中需综合考虑的。 (2) 加入诱导物 把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中会增加产量。 如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素 C. 加入巴比妥可提高利福霉素产量等。但在工业生产中还未普遍应用此技术.而 只是在选择培养
31、基组成时给以考虑。 目前工业用微生物酶多数为诱导酶. 如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。 诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。 酶的正常底物或底物的类似物都可作为诱导物。(3) 防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生 青霉素发酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以减少碳分解阻遏的发生. 是一项很有效的提高产量的方法。 . . 使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源. 葡萄糖与麦芽糖、葡萄糖与蔗糖、葡萄糖与淀粉混合碳源的利用. 也都能减少碳分解阻遏的发生。 加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减缓. 可增加金霉素的产量。 (4) 防止氮代谢阻遏的发生 避免使用高浓度的铵盐做氮源以防止氮代谢阻遏的发生.
32、 是抗生素发酵工业生产中比较成熟的经验。在抗生素产生期如补加氮源则会造成发酵逆转. 返回生长期. 抗生素的产量会大为减少。 使用亚适量(对菌体生长)的磷酸盐. 亦是抗生素发酵工业中遵循的原则之一。 为防止碳、氮、磷分解阻遏的发生. 应选用黄豆饼粉、蛋白胨类、淀粉类物质为主要原料.而 尽量少用易被迅速利用的葡萄糖等。 (5) 筛选耐前体或前体类似物的突变株 加入前体有提高次级产物产量的效果；但过量对菌体又会有毒。筛选对前体有抗性的突变株以减少或消除前体的反馈阻遏. 从而 可获得高产。 如抗苯乙酸的青霉突变株. 其青霉素的产量会增加。 半胱氨酸、缬氨酸是 -内酰胺类抗生素的前体. 筛选上述氨基酸的
33、类似物.三氟亮氨酸、DL缬氨酸的抗性菌株. 其 -内酰胺类抗生索产量会提高。 (6) 选育抗抗生素突变株 链霉素、氯霉素、金霉素筹多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。一株高产抗生索产生菌. 必然应具备 对自身所分泌的抗生索的抗性。筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株产量有数倍 增加的实验室结果已有不 少报道。 (7) 筛选营养缺陷型的回复突变株 次级代谢产物都来自初级代谢产物. 因此其营养缺陷型的产量一般都很低. 但其回复 突变型中却有不 少获得高产的例子. 其机制尚不 清楚. 估计是次生产物或其前体合成的反馈抑制被解除。在金霉素产生菌选育中
34、. 运用此方法曾获得高产菌株。 (8) 抗毒性突变株的选育 重金属离子、羟胺类物质对 -内酰胺类抗生素产生菌有毒. 但与抗生素相结合可解毒。选择适当浓度的此类毒性物质使其恰好抑制产生菌生长. 在此条件下能生长的菌株.应为抗生素类物质过量产生的突变株。曾由头孢霉素 C 对重金属离子的抗性突变株中选育到高产菌株。 . . 有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感.因为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活剂。 因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制。如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量.钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用.而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的.这些在培养基配制时都必须予以注意
35、。小结： 以上主要是从微生物的代谢调节机制出发探讨获得代谢产物过量生产的方法。但是. 微生物代谢产物特别是次级产物形成的途径和调节控制机制是相当复杂的.研究得比较清楚的只是少数。因此.上述方法的应用往往也是经验性的。 在生产实践中为提高微生物产品产量和品质经常使用的方法是诱变后随机筛选和发酵条件的优化。近年来运用遗传工程的方法以获得代谢产物的过量生产是很活跃的研究领域。. .第五章 培养基培养基（medium）是人工配制的,适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。无论是以微生物为材料的研究,还是利用微生物生产生物制品,都必须进行培养基的配制.它是微生物学研究和微生物发酵工业的基础。一、 配
36、制培养基的原则1. 选择适宜的营养物质总体而言,所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源,但由于微生物营养类型复杂,不同微生物对营养物质的需求是不一样的,因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物,因此培养自养型微生物的培养基完全可以(或应该)由简单的无机物组成。例如,培养化能自养型的氧化硫硫杆菌( Thiobacillus thiooxidans)的培养基组成见表 4-10。在该培养基配制过程中并未专门加入其他碳源物质,而是依靠空气中和溶于水中的 CO2 为氧化
37、硫硫杆菌提供碳源。表 4-10 几种类型培养基组成成份氧化硫硫杆菌培养基大肠杆菌培养基牛肉膏蛋白胨培养基 高氏一号合成培养基查氏合成培养基 LB 培养基 主要作用 牛肉膏 5 碳源（能源） 、氮源、无机盐、生长因子蛋白胨 10 10 氮源、碳源（能源） 、生长因子酵母浸膏 5 生长因子、氮源、碳源（能源）. .葡萄糖 5 碳源（能源）蔗糖 30 碳源（能源）可溶性淀粉 20 碳源（能源）CO2（来自空气）碳源 （NH4）2SO4 0.4 氮源、无机盐NH4H2PO4 1 氮源、无机盐 KNO3 1 氮源、无机盐 NaNO3 3 氮源、无机盐MgSO47H2O 0.5 0.2 0.5 0.5 无
38、机盐FeSO4 0.01 0.01 0.01 无机盐KH2PO4 4 无机盐K2HPO4 1 0.5 1 无机盐NaCl 5 5 0.5 10 无机盐KCl 0.5 无机盐CaCl2 0.25 无机盐S 10 能源 H2O 1000 1000 1000 1000 1000 1000 溶剂. .pH 7.0 7.0-7.2 7.0-7.2 7.2-7.4 自然 7.0 灭菌条件 12120 分11230分12120分12120分12120分12120分*表中培养基各组份含量均为每升培养基中该成份的克数。培养其他化能自养型微生物与上述培养基成分基本类似,只是能源物质有所改变。对光能自养型微生物而言
39、,除需要各类营养物质外,还需光照提供能源。培养异养型微生物需要在培养基中添加有机物,而且不同类型异养型微生物的营养要求差别很大,因此其培养基组成也相差很远。例如,培养大肠杆菌的培养基组成比较简单(表 4-10),而有些异养型微生物的培养基的成份非常复杂,如肠膜明串珠菌需要生长因子,若配制培养它的合成培养基时,需要在培养基中添加的生长因子多达 33 种,因此通常采用天然有机物来为它提供生长所需的生长因子。就微生物主要类型而言,有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、原生动物、藻类及病毒之分,培养它们所需的培养基各不相同。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）培养细菌(表 4-10);用高
40、氏 1 号合成培养基培养放线菌(表 4-10);培养酵母菌一般用麦芽汁培养基,它是将麦芽粉与 4 倍水混匀,在 5865条件下保温 34 小时至完全糖化,调整糖液浓度为 10 巴林, 煮沸后用纱布过滤,调 pH 为 6.0 配制而成。麦芽粉组成复杂,能为酵母菌提供足够的营养物质;培养霉菌则一般用查氏合成培养基(表 4-10)。原生动物也可用培养基培养,有的原生动物需要较多的营养物质,例如梨型四膜虫(Tetrahymena pyriformis)的培养基含有 10 种氨基酸、7 种维生素、鸟嘌呤、尿嘧啶及一些无机盐等,而有些变形虫可在较简单的蛋白胨肉汤(peptone broth)中生长。大多数
41、藻类可以利用光能,只需要 CO2、水和一些无机盐就可生长,而某些藻类如眼虫藻(Euglena)中的一些种可在黑暗条件下利用有机物质生长。有些藻类需要在培养基中补加土壤浸液,培养海洋藻类时可直接利用海水,但如果在特殊情况下需要用合成培养基培养海洋藻类时,则必需在培养基中加入海水中含有的各种盐。2.营养物质浓度及配比合适培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好,营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需,浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用,例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长,反而起到抑制或杀菌作用。另外.培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物
42、的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累,其中碳氮. .比(C/N)的影响较大。严格地讲.碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的摩尔数比值,有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如.在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中,培养基碳氮比为4/1 时,菌体大量繁殖,谷氨酸积累少;当培养基碳氮比为 3/1 时,菌体繁殖受到抑制,谷氨酸产量则大量增加。再如,在抗生素发酵生产过程中,可以通过控制培养基中速效氮(或碳)源与迟效氮(或碳)源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成。3.控制 pH 条件培养基的 pH 必须控制在一定的范围内,以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最
43、适 pH 条件各不相同,一般来讲,细菌与放线菌适于在 pH77.5 范围内生长,酵母菌和霉菌通常在 pH4.56 范围内生长。值得注意的是,在微生物生长繁殖和代谢过程中,由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累,会导致培养基 pH发生变化,若不对培养基 pH 条件进行控制,往往导致微生物生长速度或(和)代谢产物产量降低。因此,为了维持培养基 pH 的相对恒定,通常在培养基中加入 pH 缓冲剂,常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如 K2HPO4 和 KH2PO4)组成的混合物。K2HPO4 溶液呈碱性,KH 2PO4溶液呈酸性,两种物质的等克分子混合溶液的 pH 值为 6.8。当培养基中酸性物
44、质积累导致 H+浓度增加时, H +与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物,培养基 pH 不会过度降低;如果培养基中 OH-浓度增加, OH-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物,培养基 pH 也不会过度升高。但 K2HPO4/KH2PO4缓冲系统只能在一定的 pH 范围（pH6.47.2）内起调节作用。有些微生物.如乳酸菌能大量产酸,上述缓冲系统就难以起到缓冲作用,此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐(如 CaCO3)来进行调节,CaCO 3难溶于水,不会使培养基 pH 过度升高,但它可以不断中和微生物产生的酸,同时释放出 CO2,将培养基 pH 控制在一定范围内。在培养基中还存在一些天然的缓冲系统,如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性电解质,也可起到缓冲剂的作用。4. 控制氧化还原电位(redox potential)不同类型微生物生长对氧化还原电位()的要求不一样,一般好氧性微生物在 值为+0.1 伏以上时可正常生长,一般以+0.3+0.4 伏为宜,厌氧性微生物只能在 值低于+0.1 伏
