1、1,第十讲 微生物代谢工程研究进展,2,微生物代谢工程研究进展,微生物代谢工程概述 微生物代谢调节 微生物代谢工程的应用,本章内容,微生物代谢工程概述 微生物代谢调节,3,第一节 微生物代谢工程概述,细胞的生命活动是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，而代谢网络是由一系列酶的级联化学反应以特异性的膜转化系统构成。对人类的应用而言，活细胞自身固有的代谢网络的遗传特性并不是最佳的，为了积累大量的某种代谢产物，就必须要打破并重建细胞的代谢平衡。,4,1、代谢工程概念的演变,一、微生物代谢工程的概念,5,代谢工程是利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络, 并通过DNA 重组技术和应用分析生物学相关的遗
2、传学手段对细胞进行有精确目标的基因操作, 改变微生物原有的代谢或调节系统, 实现目的产物代谢活性的提高。,目前对代谢工程较系统的定义,代谢工程的研究目的通过重组DNA技术构建具有能合成目标产物的代谢网络或具有高产能力的工程菌并用于生产。,6,目前代谢工程要解决的主要问题是改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质在不同途径中的流量分布。典型目标是修饰初级次级代谢，将碳架物质流导入目的产物的理想载流途径以获得产物的最大转化率。,2、代谢工程要解决的问题,7,(1)提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量； (2)改造细胞现存的代谢途径，使其合成新产物，这种新产物可以是中间代谢产物或修饰型的最终产物；
3、 (3)对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成的新产物； (4)优化细胞的生物学特性，如：生长速率、极端环境条件和耐受性等。,3、代谢工程主要应用方向,8,4、代谢工程三个基本观点,三大观点,代谢能支撑观点,代谢网络观点,细胞经济观点,微生物代谢的复杂性,9,5、反向代谢工程,范例：利用透明颤菌血红蛋白来缓解供氧不足。Bailey 研究小组克隆了透明颤菌的血红蛋白基因, 并通过在大肠杆菌中表达该基因, 大大地提高了大肠杆菌在微氧环境中的细胞生长。,概念：是一种采用逆向思维方式进行代谢设计的新型代谢工程。就是先在异源生物或相关模型系统中，通过计算或推理确定所希
4、望的表型，然后确定该表型的决定基因或特定的环境因子，然后通过基因改造或环境改造使该表型在特定的生物中表达。,10,二、微生物代谢工程的发展历程,天然发酵时代 微生物发酵已经有几千年的历史，早在2000多年以前，人 们就开始利用微生物进行白酒、黄酒、葡萄酒、啤酒和清酒等的发酵，此时的发酵被称为。 现代发酵工业时代 20世纪40年代，随着抗生素青霉素的发酵生产的大规模进行，开始了。通过自然选择的方法，人们用10-6的突变几率来筛选所谓的高产菌株。由于没有代谢控制发酵理论作为指导，直到20世纪60年代现代发酵工业仍处于盲目阶段。,11,自然发酵时期早在数千年前，我国劳动人民就懂得酿酒、制酱油、酿醋等
5、。酿酒工业是历史上最古老的微生物工业，但当时人们并不知道它与微生物的关系，也不清楚发酵的原因，只是靠口传身授，在实践中应用微生物。,微生物代谢工程的发展历程,12,纯培养技术时期1667 年，荷兰人列文霍克发明了显微镜，揭开了微生物世界的秘密。随着微生物的发现，年法国巴斯德通过实验发现了发酵原理，认识到发酵是由微生物的活动引起的,微生物代谢工程的发展历程,13,通气搅拌的好气性发酵工程技术时期1929年，英国细菌学家傅莱明发现了青霉素。随着青霉素大规模生产的成功，实验室采用摇瓶通风培养以及空气纤维过滤的高效除菌，在20世纪40 年代创立了好气性发酵通气搅拌工程技术。,微生物代谢工程的发展历程,
6、14,人工诱变育种与代谢控制发酵技术时期随着微生物遗传学、生物化学和分子生物学的发展，日本于1956 年用发酵法生产谷氨酸获得成功，促进了20世纪60年代氨基酸、核苷酸微生物工业的建立，这是遗传水平上控制微生物代谢的结果。,微生物代谢工程的发展历程,15,发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期随着微生物工业向大型发酵罐的连续化、自动化方向发展，以数学、动力学、化工原理等为基础，通过计算机实现发酵过程自动化控制的研究，使发酵过程的基本参数均可自动记录和控制。,微生物代谢工程的发展历程,16,微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时期随着微生物酶反应生物合成与化学合成工程技术的结合，矿产物的
7、开发和石油化工的发展为化学合成法提供了丰富的原料，用于生产一些低分子的有机化合物，如乙醇、丙酮及丁醇等，可生产许多过去不能生产的有用物质。,微生物代谢工程的发展历程,17,三、微生物代谢研究的相关领域,（一）微生物代谢组学研究概念：是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后出现的一门新学科。是通过考察生物体系收到刺激或扰动后所有小分子代谢产物随时空变化情况，来研究生物体系的代谢途径的一种技术。代谢组学优点(1)基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平得到放大；(2)代谢组学的研究不需要进行全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库；(3)代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目：(4)由于给定的代谢物在每
8、个组织中都是一样的，所以，研究中采用的技术更通用。,18,（二）微生物代谢产物库研究,1.预分离代谢物库：首先多种菌株的培养液过滤，其次经不同吸附性色谱柱、半制备高效液处理细分得到多种一定纯度的天然化合物，最后对化合物库中活性成分进行液相-质谱、核磁共振分析，排除重复性物质。2.纯天然产物库：首先选择培养条件简单，能产生多种含量丰富未知代谢物的微生物作为实验对象。采用高效液相结合蒸发散射检测器对所选微生物进行预筛选,从中挑选出目的菌株做进一步的扩大培养。其次提取物先浓缩、分离，最后通过查询天然产物数据库结合质谱、核磁共振信息对分离获得化合物进行高通量结构鉴定从而得到微生物代谢化合物。,19,（
9、三）微生物代谢分子生化技术研究,基因敲除 启动子和细胞全局转录机制的定向进化,20,1、基因敲除,基因敲除是利用微生物体内的同源重组系统，在一定选择压力下使体外改造的某功能基因与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组，从而改变细胞的遗传特性。通过阻断细胞的代谢旁路，或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量，从而达到微生物育种的目的。,例如在提高产物纯度上：乳酸菌LactobacillushelveticusCNRZ32既有KylaD乳酸脱氢酶基因(ldh L)，又含L乳酸脱氢酶基因(1dhD)等。用基因替代的方式构建了2株菌GRL86和GRL89，其中GRL86菌株缺失了ldhD的启动子
10、区域；GRL89菌株中用另一个ldhL基因替代了ldhD基因，新增加的ldhL在原来ldhD启动子的调控下表达敲除后，两株菌都只生产L-乳酸，且L-LDH的最高活性分别比原始菌株高出53和93。,21,提高通向目标产物的代谢流增强催化某反应的酶的表达量和活性或在有竞争途径存在时，阻断分支代谢途径，从而提高代谢流，达到提高目标产物产量的目的。 扩展代谢途径通过基因工程手段引入外源基因（簇）等，使原有代谢途径进一步向前或向后延伸，从而可利用新的原料用于合成目标产物或产生新的末端代谢产物 。 构建新的代谢途径一般指引入外源基因（簇）来改造和修饰代谢网络，转移代谢途径或将无关的代谢途径相连使细胞从不能
11、合成某种代谢产物转变为能合成此代谢产物。,四、代谢工程研究的设计思路,22,自然分离,随机突变,鉴定目标代谢途径,绘制细胞代谢图谱,代谢分析,代谢网络定量分析,待修饰基因靶点的确定,待阻断途径靶点的确定,待导入途径靶点的确定,基因操作,代谢设计,代谢流分析,工程菌或细胞品质检测、遗传稳定性试验,细胞培养工艺优化控制,投入生产或运用,基因操作,效果分析,代谢工程路线,否,是,代谢工程的基本过程,23,五、代谢工程的研究手段,1、采用遗传学手段的遗传 菌种改良 酶的合成或酶活的提高2、生物合成途径的代谢调控支路代谢的切除 转移代谢途径或将无关代谢相连,24,从野生型大肠杆菌出发，将来自假肠膜明串珠
12、菌Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 菌株的甘露醇脱氢酶与果糖转运蛋白编码基因整合到大肠杆菌ATCC8739 的染色体中，并失活其他的发酵途径 (丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶、富马酸还原酶、乙醇脱氢酶、甲基乙二醛合成酶和丙酮酸氧化酶) ，构建了一株遗传稳定的D-甘露醇生产菌株。,25,第二节 微生物代谢调节,微生物代谢的代谢类型和自我调节初级代谢调节次级代谢调节,26,现代发酵工业要研究的主要内容就是通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径改变或代谢调节失控而获得某一发酵产物的过量产生。其方法大体可分为两类：多种方法育种选育基因突变株控制
13、培养条件，调节代谢,27,代谢调节(regulation of metablism）是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。,微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制，以期按照人们的愿望，生产有用的微生物制品。,28,细胞内发生的各种化学反应的总称为代谢！,（一）代谢类型,一、微生物代谢的代谢类型和自我调节,29,（二）代谢自我调节部位（方式）,细胞透性的调节 代谢途径区域化 代谢速度的调控,30,1、细胞透性的调节,细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。 细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要
14、方式，由它控制着营养物质的吸收和产物分泌。,31,2、代谢途径区域化,原核微生物细胞结构虽然简单，但也划分出不同的区域，与某一代谢途径有关的酶系则集中某一区域，以保证这一代谢途径的酶促反应顺利进行，避免了其他途径的干扰。 例如呼吸的酶系集中在细胞质膜上；而与蛋白质合成有关的酶系则位于核蛋白体上；分解大分子的水解酶，在革兰氏阴性菌里是位于壁膜间隙中，而革兰氏阳性菌则将这些水解酶类，分泌于胞外。,32,在真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布。,如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上；蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上；DNA合成的某些酶位于细胞核里。,33,3、代谢速度的调控,微生物通过调节酶
15、的活性和酶量来控制代谢物的流量。 微生物在不同条件下能按照需要，通过激活或抑制原有酶的活性或通过诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代谢速度，使之高度经济有效地利用能量和原料进行生长繁殖。,34,初级代谢微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢生成维持生命活动的物质和能量的过程。,初级代谢类型,二、初级代谢调节,酶合成调节酶活性调节,35,1、酶合成的诱导,诱导酶是微生物需要它们时才产生的酶类，所以诱导的意义在于它为微生物提供了一种只是在需要时才合成酶、以避免浪费能量与原料的调控手段。,乳糖是大肠杆菌-半乳糖苷酶合成的诱导剂。,（一）酶合成的调节,36,2、酶合成的阻遏,微生物代谢过程中
16、，当胞内某种代谢产物积累到一定程度时，不仅可以反馈抑制产物合成途径中某种酶的活性，还可以阻遏酶的继续合成。,37,（1）末端产物阻遏 由于终产物的过量积累而导致的生物合成途径中酶合成的阻遏称为终产物阻遏。 常发生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等这些重要结构元件生物合成的时候。正常情况下，当微生物细胞中的氨基酸、嘌呤和嘧啶过量时，与这些物质合成有关的许多酶就停止合成。,38,意义有效地保证了微生物细胞内氨基酸等重要物质维持在适当浓度，不会把有限的能量和养料用于合成那些暂时不需要的酶。 微生物通过终产物阻遏与反馈抑制的完美配合有效地调节着氨基酸等重要物质的生物合成。,39,（2）分解代谢产物阻遏：葡萄糖效应
17、葡萄糖常对分解利用其他底物的有关酶的合成有阻遏作用，因为葡萄糖的分解代谢产物阻遏了分解利用其他底物的有关酶合成的结果。 分解代谢产物阻遏导致所谓“二次生长”，即先是利用葡萄糖生长，待葡萄糖耗尽后再利用另一种底物生长，两次生长中间隔着一个短暂的停滞期。,40,3、酶合成调节机制,乳糖操纵子调控模型,41,1、激活,在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。,（二）酶活性的调节,酶活性调节类型：激活和抑制,42,代谢调节的激活作用：代谢物对酶的激活。 前（体）馈激活，指代谢途径中后面的酶促反应，被该途径中较前面的一个中间产物所促进。 代谢中间产物的反馈激活，
18、指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用。,43,前（体）馈激活和反馈激活示意图,例1:糖代谢途径中丙酮酸积累激活丙酮酸羧化酶。例2：乙酰CoA的积累激活PEP羧化酶。,44,酶 的 反 馈 激 活,45,2、抑制,抑制：由于某些物质的存在，降低酶活性的现象。可逆或不可逆。,反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑 制。反馈抑制作用在生物体内普通存在，它在维持细胞正常代谢、经济有效地利用代谢原 料、以及适应环境的变化，都具有重要作用。,46,（三）酶活性调节的机制,变构调节 化学修饰,47,变构调节 有些酶除了活性中心外，还有一个或几个部位，当特异性分子非共价
19、地结合到这些部位时，可改变酶的构象，进而改变酶的活性，酶的这种调节作用称为变构调节。, 具有变构作用的酶称为变构酶。 变构酶分子组成，一般是多亚基的，分子中凡与底物分子相结合的部位称为催化部位(catalytic site)，凡与效应剂相结合的部位称为调节部位(regulatory site)。,48,变构调节机制,49,化学修饰,某些酶蛋白肽链上的侧链基团在另一酶的催化下可与某种化学基团发生共价结合或解离，从而改变酶的活性，这一调节酶活性的方式称为酶的共价修饰。 酶的共价修饰以磷酸化修饰最为常见。酶的共价修饰是体内酶活性快速调节的另一种重要方式。,50,如：肌肉糖元磷酸化酶的酶促化学修饰。该
20、酶有两种形式，即无活性的磷酸化酶b和有活性的磷酸化酶a。磷酸化酶b是二聚体，在酶的催化下，使每个亚基分别接受ATP供给的一个磷酸基团，转变为磷酸化酶a，后者具有高活性。两分子磷酸化酶a二聚体可以再聚合成活性较低的(低于高活性的二聚体)磷酸化酶a四聚体。,51,在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代谢途径中，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用。 分支代谢的反馈调节方式有多种。,分支代谢途径,四、分支代谢途径的调节,52,（一）顺序反馈抑制 （sequential feedback inhibition
21、 ）,分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制代谢途径中的第一个酶，而是分别抑制分支点后的反应步骤，造成分支点上中间产物的积累，这种高浓度的中间产物再反馈抑制第一个酶的活性。,53,54,（二）同工酶的反馈抑制 （isoenzyme feedback inhibition ）,同功酶是指能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。 其特点是：途径中第一个反应被两个不同的酶所催化，一个酶被H抑制，另一个酶被G抑制。只有当H和G同时过量才能完全阻止A转变为B。,55,56,（三）协同反馈抑制（concerted feedback inhibition）,在分支代
22、谢系统中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，如果末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。,57,例如，荚膜红假单胞菌中天门冬氨酸族氨基酸生物合成途径中，天门冬氨酸激酶(AK)是受末端产物赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。,58,（四）累积反馈抑制（cumulative feedback inhibition）,在分支代谢途径中各种末端产物单独过量时，它们各自能对途径中的第一个反应的酶仅产生较小的抑制作用。一种末端产物单独过量并不影响其它末端产物的形成，只有当几种末端产物同时过量时，才对途径中的第一个酶产生较大的抑制。,59,（五）增效反馈抑制 （cooperativ
23、e feedback inhibition）,增效反馈抑制既不同于协同反馈抑制又不同于累积反馈抑制。 在一个分支代谢途径中，几种末端产物单独过量时，仅产生对共同途径的第一个酶部分的抑制。如果每种末端产物都过量时，其抑制作用则超过各种末端产物单独过量时抑制的总和。,60,61,（五）能荷调节,能荷指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。能荷调节指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动，也称腺苷酸调节。能荷不仅调节形成ATP的分解代谢酶类（如磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合成酶等）的活性，也调节利用ATP的生物合成酶类（如柠檬酸裂解酶、磷酸
24、核糖焦磷酸合成酶等）的活性。,62,次级代谢次级代谢是在一定的生长时期（一般是稳定生长期），微生物以初级代谢产物为前体合成的对微生物本身的生命活动没有明确功能的物质的过程。,三、初级代谢调节,酶合成的诱导调节 反馈调节,次级代谢的调节类型,63,1、酶合成的诱导调节,把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中可增加产量。,64,2、反馈调节,次级代谢产物的自身反馈抑制和反馈阻遏分解代谢产物调节初级代谢产物的调节磷酸盐调节,65,次级代谢产物的自身反馈抑制和反馈阻遏,如青霉素、链霉素、卡那霉素等的生物合成途径中都发现末端产物的反馈调节作用。,66,分解代谢产物调节,碳分解代谢阻遏或
25、抑制能迅速被利用的碳源（葡萄糖）或其分解代谢产物，对其他代谢中的酶（包括分解酶和合成酶）的阻遏和抑制。葡萄糖是菌体生长良好的碳源和能源，但对青霉素、头孢菌素、卡那霉素、新霉素、丝裂霉素等都有明显降低产量的作用。,67,3、防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生, 青霉素发酵中限量流加葡萄糖或糖蜜以减少碳分解阻遏的发生。, 使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源。, 加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减慢，增加金霉素的产量。,68,氮分解代谢产物的抑制作用以铵盐作为链霉素产生菌的唯一碳源，可抑制链霉素的合成。避免使用高浓度的铵盐作氮源以防止氮代谢阻遏的发生，是抗生素工业成熟的经验。,69,初
26、级代谢产物的调节,次级代谢产物与初级代谢产物有一条共同的合成途径；初级代谢产物直接参与次级代谢产物的合成。,70,71,磷酸盐在微生物的生长和代谢产物合成中起着重要的作用，高浓度的磷酸盐对抗生素等次级代谢产物的合成表现出较强的抑制作用。 磷酸盐对次级代谢产物的抑制主要是通过抑制酶或导致细胞能荷变化等。,磷酸盐调节,72,3、常用的提高次级代谢产物产量的方法,补加前体类似物 加入诱导物 防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生 防止氮(磷)代谢阻遏的发生 筛选耐前体或前体类似物的突变株 选育抗抗生素突变株,73,（1）补加前体或其类似物 在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的
27、有效方法。 如青霉素G的生产中，苯乙酰-CoA是限速性因子，补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。,74,（2）加入诱导物把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中会增加产量。 如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素C，加入巴比妥可提高利福霉素产量等。 但在工业生产中还未普遍应用此技术，而只是在选择培养基组成时给以考虑。,75,（3）防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生 青霉素发酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以减少碳分解阻遏的发生，是一项很有效的提高产量的方法。 使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源能减少碳分解阻遏的发生。 加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减缓，可
28、增加金霉素的产量。,76,（4）防止氮(磷)代谢阻遏的发生 避免使用高浓度的铵盐做氮源，以防止氮代谢阻遏的发生，是抗生素发酵工业生产中比较成熟的经验。在抗生素产生期如补加氮源则会造成发酵逆转，返回生长期，抗生素的产量会大为减少。 使用亚适量(对菌体生长)的磷酸盐，亦是抗生素发酵工业中遵循的原则之一。 为防止氮、磷分解阻遏的发生，应选用黄豆饼粉、蛋白胨类物质为主要原料，而尽量少用易被迅速利用的无机氮源。,77,（5）筛选耐前体或前体类似物的突变株加入前体有提高次级产物产量的效果；但过量对菌体又会有毒。筛选对前体有抗性的突变株可以减少或消除前体的反馈阻遏，从而可获得高产。 如抗苯乙酸的青霉突变株，
29、其青霉素的产量会增加。 半胱氨酸、缬氨酸是-内酰胺类抗生素的前体，筛选上述氨基酸的结构类似物(三氟亮氨酸、D-缬氨酸)的抗性菌株，其-内酰胺类抗生素产量会提高。,78,（6）选育抗抗生素突变株 链霉素、氯霉素、金霉素筹多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。一株高产抗生素产生菌，必然应具备对自身所分泌的抗生素的抗性。筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。 如：金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株，产量有数倍增加。,79,第三节 微生物代谢工程的应用,80,农业方面环境方面医疗食品方面工业发酵方面,微生物农药,污水处理 土壤净化,临床治疗药物 高附加值保健品食品防腐剂,改进由微生物合成
30、产物的得率和产率 扩大可利用基质范围合成 对细胞而言是新的产物或全新产物,应用,81,微生物农药是生物农药的一种，是指微生物及其微生物的代谢产物加工而成的，具有杀虫、 杀菌、 除草、 杀鼠或调节植物生长等活性的物质。,一、农业方面的应用,微生物农药分类 (有效成分),农用抗生素 活体微生物农药,82,农用抗生素是微生物在生长代谢过程中所产生的次级代谢产物，此类物质在低微浓度时即可抑制或杀灭作物的病、虫、草害或调节作物生长发育。 包括阿维菌素、浏阳霉素、杀蚜素、南昌霉素、关霉素等。目前世界上销量最大的是阿维菌素，是一种超高效的杀虫生物农药，用量仅200-500mg/亩，主要用于防治螨类、潜叶蛾、
31、梨木虱、斑潜蝇、小菜蛾、菜青虫等害虫。,1、农用抗生素,83,活体微生物农药是指用对某些昆虫有致病或致死作用的杀虫菌及其所含有的活性成分制成的生物杀虫制剂。苏云金芽孢杆菌是研究最多的杀虫细菌。它最早由日本人石渡于1901年从家蚕病尸虫体中分离出来。Bt是目前世界上用途最广，产量最大，应用最成功的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的95%以上，已有60多个国家登记了120 多个品种。,2、活体微生物农药,84,BT的杀虫原理,害虫,肠内碱性环境,毒素,释放,中肠麻痹,肠壁破损,血液,引起败血症,芽孢在腔内迅速繁殖,死亡,85,有食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷
32、曲，死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。害虫把Bt细菌吃到肚子里，再经过一个发病过程，才能死掉，大约48小时方能达到杀灭害虫的目的。,害虫中毒症状,86,真菌杀虫剂 真菌杀虫剂在微生物杀虫剂中所占种类最多，已发现的杀虫真菌约100多个属，800多个种。 白僵菌（Beauveria bassiana）是一种广谱性的昆虫病原真菌，对700多种有害昆虫都能寄生，致病性和适应性强。,我国用来防治玉米螟和松毛虫 欧洲用来防治西方五月鳃金龟 巴西用来防治小蔗螟,取得显著地成效,87,白僵菌杀虫效果图,88,白僵菌杀虫原理,白僵菌孢子,温度和湿度,生长菌丝,菌丝穿透虫体壁伸入虫体内,产生大量菌丝和分泌物,虫尸白色僵硬
33、,因虫尸体表长满菌丝和白色粉状孢子，故名“白僵菌”,白僵虫,死亡,约经45天后,89,虫尸上的孢子又可借助风力扩散，或害虫主动接触虫尸，继续侵染其它害虫个体，使疫病蔓延造成害虫大量死亡。一个侵染周期710天。白僵菌对人畜无毒，对蚕染病力极强，是家蚕的一种毁灭性病害，在养蚕区切勿使用。,90,环境方面应用,污水处理技术是利用微生物正常代谢过程对废水中各种污染物进行迁移和转化作用，使废水得到净化的目的。,污水处理,污水中有机物的降解,水质浑浊、色深、具有恶臭、呈微碱性，有机成分占全部悬浮物总量的四分之三以上。,微生物群体依靠细胞壁将污水中的有机物质吸收消化，同时产生一定的代谢物质，再作为其他微生物
34、的养料，进行吸收消化，周而复始，直至污水中的有机物质全部分解。,生活污水特征,处理原理,91,废水中重金属的除去,重金属污染源,铅、铜、汞、镉、砷、铬、镍。,微生物处理重金属污染途径：,细菌生长释放蛋白质能使溶液中微量可溶性的 Cd2+、Hg2+、Cu2+、Zn2+形成不溶性的沉淀而被除去,金属离子与细胞表面活性基团络合/离子交换以及络合基团为晶核进行吸附沉淀。,金属可以被富集在细菌、真菌、海藻细胞内。,我国每年有 1200万吨粮食遭到重金属污染，直接经济损失超过 200亿元。,92,93,抗生素 抗氧化剂 抗癌药物 抗病毒药物 抗寄生虫药物 抗高血压药物 维生素和激素 降低胆固醇药物,医药领
35、域的应用,临床治疗药物,代谢工程通过合成药物逐渐实现临床应用。,代谢工程,94,例如，通过基因工程设计全新的路线所获得蛋白质类药物,如利用大肠杆菌表达系统或酿酒酵母表达系统获得的低成本高剂量的人胰岛素。,95,单细胞蛋白单细胞微生物产生的细胞蛋白称单细胞蛋白(SCP)，是一种与动植物蛋白并存的微生物来源的蛋白质。,2019/11/2,95,高附加值保健品,单细胞蛋白,微生物菌体保健饮料,类型,SCP优点,生产速度快 周期短,如500 kg的牛，24h可合成0.5kg的蛋白质，而500kg的菌体，24h可产1250kg的蛋白质，是牛的2500倍，因此可应用于大规模的工业化生产且生产条件简单。,9
36、6,2019/11/2,96,微生物菌体保健饮料,食用菌,有效成份,功效,世界上已开发出多种微生物蛋白饮料，如用酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、芽抱菌各种细菌以及曲霉、毛霉各种真菌，均可用来生产微生物蛋白饮料。,现使用高温酸法、碱法等法，制成酵母、细菌、霉菌高蛋白饮料，类似酸奶和酸酪，其营养价值胜过牛奶，如国际上生产出的酵母蛋白饮料深受欢迎,特别适用于婴儿及病人饮用。,97,食品防腐剂防腐剂作为食品添加剂的一种，在食品添加剂中占有很大比重，部分化学合成的防腐剂能够在体内积累引起中毒、疾病、致癌。但某些微生物本身或其代谢产物具有抑菌防腐的功效，是一种安全无毒，天然高效的食品防腐剂。2010年据统计我国食
37、品添加剂行业产量在710 万吨左右，权威部门预计， “十二五” 期间2015 年底我国食品工业年度总产值将突破 14 万亿元 ( 人民币) 。,98,目前已经广泛应用的几种微生物食品防腐剂,99,1990年1月卫生部批准乳酸链球菌素可作为食品防腐剂使用，是可生物降解的无毒天然防腐剂。,次级代谢产物，属于细菌素的一种,100,1982年6月，美国FDA正式批准纳他霉素作为食品防腐剂应用食品工业中。摄入人体中的纳他霉素大部分会随着粪便排出，不会在人体内的富集。,纳塔尔链霉菌、恰塔努加链霉菌、褐黄孢链霉菌,次级代谢产物,真菌、酵母菌、原生动物、藻类，对细菌、病毒没有抑制作用,纳他霉素( Natamy
38、cin),产品类型,抑 菌 普,生产菌种,抑菌原理,纳他霉素能与真菌细胞膜上的甾醇化合物反应，引发细胞膜结构改变而破裂，导致细胞内容物渗漏，最终失活死亡。,101,2003年10月聚赖氨酸被美国FDA批准为安全食品保鲜剂。,聚赖氨酸,生产菌种,产品功能,白色链球菌,防腐和营养强化双功能,产品类型,阳离子聚合多肽防腐剂,作用于微生物细胞壁，溶菌酶能通过蛋白质空间结构中的活性中心水解细菌细胞壁肽聚糖上的 N乙酞胞壁酸，和 N乙酸葡萄糖胺之间形成的1，4糖苷键并使其断裂，细胞壁破损，细胞内容物外漏，最终导致细胞自溶死亡。,102,目前在美国，日本等国作为食品防腐剂广泛应用，在欧洲溶菌酶作为食品防腐剂
39、已经代替亚硫酸盐。,多肽链组成,还有其他一些微生物防腐剂还未被广泛应用红茶菌、红曲、纳豆菌。,103,通过基因重组技术提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量；也可对不同细胞的代谢途径进行拟合，改造细胞现存代谢途径，使其合成新产物。,工业发酵方面应用,L-苯丙氨酸合成纳他霉素的合成,得率的提高 培养基质扩大 及新产品的合成方面,104,提取法 化学合成法 酶法 发酵法,初级(次级)代谢产物的制备方法,105,L-苯丙氨酸合成的中央代谢途径,L-苯丙氨酸合成,106,L-苯丙氨酸的合成代谢支路,107,中央代谢途径的调控 苯丙氨酸生物合成支路的代谢调控,108,（1）构建PEP羧化酶阴性E.coli
40、突变株，切断PEP到OAA的代谢通路，使L-苯丙氨酸的产量提高了6倍； （2）去除Bacillus subtilis编码Pyr激酶的基因，降低丙酮酸激酶的表达量； （3）在E.coli中串联表达PEP合成酶和PEP羧化激酶基因，提高PEP产量。,中央代谢途径的调控策略,1、增加PEP的合成量,2、增加E4P的合成量,超量表达转酮酶基因。例：在Corynebacterium glutamicum 中超量表达转酮酶，E4P水平提高，苯丙氨酸产量提高5%-20%。,109,中央代谢途径的改变往往会对细胞产生较大压力。其形成因素包括蛋白质的超量表达和代谢流水平的波动，严重影响细胞生长和代谢流。,110
41、,L-苯丙氨酸生物合成支路的代谢调控,L-苯丙氨酸生物合成支路的代谢调控,111,E.coli的代谢调控通过E.coli选育具有L-酪氨酸和L-色氨酸双重营养缺陷型突变株，可积累L-苯丙氨酸7.4 g/L。将抗反馈抑制的分支酸变位酶预苯酸脱水酶基因构建入E.coli中进行发酵生产，L-苯丙氨酸最高产量达到50 g/L。,112,超量表达分支酸变位酶预苯酸脱水酶基因，可使L-苯丙氨酸产量达26g/L。从Corynebacterium glutamicum中克隆了分支酸变位酶，再将该酶的基因插入Corynebacterium glutamicum，L-苯丙氨酸的产量达19g/L，是基因导入前的1.
42、5倍；同时向该菌中导入分支酸变位酶及预苯酸脱水酶的双酶基因，L-苯丙氨酸的产量再上升到23g/L。,Corynebacterium glutamicum的代谢调控,113,那他霉素( Natamycin)是一种广谱的多烯大环内酯类抗真菌抗生素。是从恰塔努加链霉菌中分离出的抗生素。由于它高效的抑菌效果而被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗。那他霉素成为我国批准使用的仅有的2种食品生物防腐剂之一。,那他霉素合成,114,那他霉素的菌种选育,基因序列分析,同源性比较,合成途径的特异性正调控基因,重组质粒pLY2,经验证,基因工程育种（2010年，程良英）,Southem杂交,scnRI,恰塔努
43、加链霉菌基因组 文库柯斯质粒pMRD46,引物移步测序、克隆,Np(自身启动子)与链霉菌 整合表达载体连接,大肠杆菌-链霉菌结合转移方法,多拷贝基因工程菌株恰塔努加链霉菌,得到发酵单位比出发菌株提高了27%菌株,115,链霉菌的次级代谢调控途径，在遗传水平上可分为三个层次。特异性调控-途径特异性调控为最低层次的调控,这些途径特异性调控基因通常位于相应的抗生素生物合成基因簇内部。那塔尔链霉菌(S.natalensis)中调控那塔霉素合成的基因有PimM、PimR等。,那他霉素次级代谢调控途径,116,多效调控-为链霉菌次级代谢的最高调控水平,它可对链霉菌抗生素的产生，形态分化等进行调控。全局调控
44、-链霉菌中存在着原核型和真核型两种双组分全局调节系统,它们对链霉菌的次级代谢和形态分化进行全局调控,全局调控基因一般位于抗生素生物合成基因簇外面。,117,多烯大环内酯生物合成内酯大环的生物合成（多聚乙酰途径）活化前体的生成（乙酰CoA和丙二酰CoA）氨基糖的形成 影响那他霉素前体合成的因素糖酵解(EMP)合成途径中的限速酶丙酮酸脱氢酶系 三羧酸循环酶系丙酮酸羧化酶脂肪酸合成的前提限速酶,多烯大环内酯类抗生素的生物合成途径,118,那他霉素的生物合成途径,三羧酸循环,119,草酸乙酸是多烯内酯大环生物合成中的限制性中间产物高产抗菌素前提 高含量草酰乙酸菌株库 高活性磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,葡萄
45、糖氧化过量的ATP,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,柠檬酸合成酶,柠檬酸和异柠檬酸,草酸乙酸脱羧酶,草酸乙酸,抑制了那他霉素,反馈抑制,减少,激活,减少,间接抑制,120,与脂肪酸聚合的机制相同,所以培养基中含有长链脂肪酸会对那他霉素的形成有反馈抑制作用，说明其重要前体物是短链脂肪酸。,那他霉素发酵工艺优化,那他霉素 内酯环,聚合,聚酮体,121,杜连祥（2003年）从摇瓶生长曲线中可以看出，在发酵培养基中，褐黄抱链霉菌在77h左右开始进入稳定期。由于那他霉素的合成属于次级代谢，所以这可为研究前体物的最适加入时间提供依据。,按照那他霉素的生物合成途径，促进其产量提高的前体物应该是2C, 3C单位，取0.2%的乙酸钠、丙酸钠、丙二酸钠三种盐，于0h分别各加入发酵培养基中，发酵96h后，测定那他霉素产量，得出，加入0.1%丙酸钠时的那他霉素产量最高。,122,美国专利5942611报道了一种有效的提取高质量那他霉素的方法。该方法通过错流过滤和调节pH的方法得到那他霉素的晶体。通过这种方法，干燥产品纯度可达94%99%，那他霉素回收率可达40%70%。,那他霉素的提取,那他霉素的提取,提取率达到78%,提取率达到95%,
