1、福林-酚法 测定蛋白质的含量,实验目的,学习测定蛋白质浓度的原理和方法熟练分光光度计，微量移液器的操作以及标准曲线的制作,实验原理,第一步双缩脲反应（蛋白质与碱性铜试剂反应）,在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物,第二步与福林-酚试剂反应在碱性条件下 ，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原福林酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，生成钨蓝和钼蓝的混合物，呈蓝色。可利用分光光度计测得650nm的OD值，浓度大小跟OD值成正比y=kx+bOD值是optical density（光密度）：入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值,实验原理,分光光度计的原理,制作标准曲线：(
2、1）选择标准蛋白溶液(牛血清白蛋白），配制一定浓度母液配制标准溶液浓度梯度，测定对应的OD值(3）根据浓度和OD值得回归方程即标准曲线利用excele软件 如何制作？如何评估？,x1y1 x2y2 x3y3. . . .Xnyny=kx+b,实验方法,实验方法,实验方法,以0号管为空白对照，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度 值（OD值），标准蛋白含量g （或者标准蛋白浓度）作为横坐标，OD值作为纵坐标，制作标准曲线写出回归方程，根据待测样品OD值计算蛋白质含量。注意事项： 及时做好标记 加入试剂后应立即混匀 测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内,分光光度计的使用方法,设置波长
3、 设置样品池个数 调零 测定开启机器，调节所需的波长，设置样品池个数空白对照管调零（一定放在离自己最近的那个样品池）将待测样品液放入比色皿（2/3高度），并将比色皿放入样品池内，盖好盖子，测光密度值（OD值），按上下键翻看其他样品池的数据测量完毕，一定把比色杯用自来水和蒸馏水重新洗净，倒置于滤纸上晾干,比色皿有光面和毛面，勿用手触摸光面，使用时光面对准光路。装液体时，需达到比色皿2/3左右；若液体不慎溢出，需用纸巾吸干，仪器如果沾有液体，请迅速擦干。,注意事项,微量移液器的使用,原理微量移液器是根据“虎克定律”设计的，“在一定限度内弹簧伸展的长度与弹力成正比”：也就是微量加样器吸入液体的容量与
4、加样器内的弹簧拉伸长度成正比。 常见种类0.510l 550l10100l20200l (读数窗显示20200, 每转1档1l) 1001000l(读数窗显示1001000, 每转1档为5l),1：选择量程根据转移液体的量，选择正确量程的微量移液器 2：调节吸量体积：将微量移液器调至所需体积，千万不要将读数的调节超出最大值和最小值；,操作步骤,3：吸量 用移液器的吸杆插上合适的吸头，旋紧。 握紧微量移液器，用大拇指按至第一档，将吸头插入溶液中。 然后松开大拇指，慢慢释放按钮以吸取液体（否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部）；然后将微量移液器移出液面。 释放液体时，枪头接触在容器壁上，
5、先慢慢按至第一档，停留12秒后，再按至第二档以排出所有液体。,操作步骤,4. 更换吸头：吸取不同的液体，一定要更换枪头，防止试剂交叉污染，更换枪头时，对着废弃桶，轻轻按下卸载吸头的弹射器，吸头自然脱落在废弃桶内。 5. 微量移液器的放置：实验完毕后，将移液器调回到接近最大量程，使弹簧处于松弛状态，放到或者悬挂在架子上。,操作步骤,1. 吸取不同的液体时，切记要更换吸头， 2. 调节移液器时，动作要轻缓，千万不要将读数的调节超出最大值和最小值，否则会造成损坏。 3. 吸取液体时，动作要轻缓，防止液体随着气流进入移液器的上部； 4. 带有残余液体吸嘴的移液器不能平放。 5. 每次实验完毕后将微量移液器调至接近最大刻度，使弹簧处于自然伸展状态。 6. 必须定期让专业人员进行校正，不能火烧灭菌，不能摔。,注意事项,常用的测定蛋白质含量的方法,1：双缩脲法 2：福林酚法 3：考马斯亮蓝法 4：BCA法 5：紫外吸收法 6：凯氏定氮法,
