1、垦匿艘垣堂苤查!Q!生!旦笠!鲞筮!塑!型Q!：!型!翌!Q!：!：丝：盟!：!纳米技术在循环肿瘤细胞中的研究进展高洋袁周【摘要】 循环肿瘤细胞(CTC)对于监测肿瘤复发及判断预后具有重要意义。纳米技术为检测CTC提供了良好的平台，使CTC的应用具有广阔的发展前景。同时，利用纳米技术设计杀灭CTC的纳米装置在清除CTC方面有广阔的应用前景，为肿瘤治疗提供了新的研究方向。【关键词】肿瘤循环细胞；纳米技术；肿瘤转移；治疗；检测Research progress of nanotechnology in circulating tulfflor cells Gao拖增，Ynan ZhouDepart
2、ment ofGeneral Surgery，Sixth PeopleS Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200233，ChinaCorresponding author：Yuan Zhou，Email：zhouyuar嘏51163corn【Abstract】Circulating tumor cells(CTCs)play pivotal roles for monitoring the tumor metastasis andprognosisThe nanotechnology provides a
3、 favourable platform for CTCs detection，and enables CTCs to be morepromising for practical applicationMeanwhile，the nanoscale device by virtue of nanotechnology has broadapplication prospects in eliminating CTCs and offers a new direction in the field of anticancer【Key words】Neoplasm circulating cel
4、ls；Nanotechnology；Neoplasm metastasis；Therapy；Detection循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是从原发肿瘤病灶及继发性肿瘤病灶脱落进入外周血的肿瘤细胞，能够通过循环系统转移到远处器官导致肿瘤患者死亡。CTC是肿瘤转移的前奏，也是判断肿瘤患者生存时间的独立预测因子。纳米技术在纳米尺度对于物质进行检测和操作，是一门融合化学、生物学、物理学和药学的交叉学科，在肿瘤的监测和个性化治疗方面具有广阔的应用前景。运用纳米技术研究CTC诞生了许多新技术，如CellSearchllj、Adna系统拉1、免疫磁性纳米载体J、快速检
5、测方法H、核酸适体J、磁泳技术61等。1纳米技术在CTC检测中的应用11 CellSearch检测系统目前用于检测CTC的金标准是CellSearch，是唯一一种经美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于检测CTC的方法。CellSearch检测方法的出现对于CTC的研究具有里程碑式的意义，此后针对各种肿瘤的CTC研究成果不断被报道。CellSearch检测系统是一种半自动化的检测系统，在检测过程中，细胞表面抗原为EpCAM+CK+CD45一被认为是肿瘤细胞。目前已明确通过CellSearch检测到的CTC数量能预测乳腺DOI：103760cmajissn1673-422X201501012作
6、者单位：200233上海交通大学附属第六人民医院普外科通信作者：袁周，Email：zhouyuan851163con综述癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌的肿瘤无进展生存期和总生存期。7 o，是预测预后的独立指标。尽管CellSearch系统是目前检测CTC的金标准，然而它也有局限性。首先，并非所有的CTC都表达上皮细胞黏附分子(EpCAM)，一些肿瘤细胞株(BCK1、BCP1和BCS1)在转化过程中细胞角蛋白(CK8、CKl8和CKl9)表达缺失。8 J，这些细胞就无法被检测出。其次，在检测CTC的过程中，由于经过离心、透化等处理过程，分离出来的CTC无法进行进一步培养分析，也无法进行进一步研究。
7、因此其他检测CTC的方法不断出现。12 Adna检测系统由于外周血中CTC的含量极低，因此所需要的检测方法必须要有很高的敏感性，反转录一聚合酶链反应(RTPCR)技术能够为这些微量细胞提供较高的敏感性和可行性。AdnaTest乳腺癌细胞检测系统是一种新型检测CTC的方法，在小鼠血稀释实验中，1 ml血液中可检测到1个CTC。9|。首先血样经过针对抗一EpCAM抗体修饰的免疫磁珠富集，分离的细胞被溶解，使用寡脱氧胸苷酸磁珠使mRNA分离，经过反转录，然后使用多重PCR技术分析3种肿瘤相关反转录产物：癌胚抗原、表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor，EGF
8、R)、GA7332。PCR产物使用毛细管电泳分析，这种方法在69的转移性乳腺癌中能够检出CTC。根据检测肿瘤的不同可以设万方数据国区盟瘤堂盘查!Q!生!旦筮丝鲞箍!塑!坐Q!：塑!型!Q!：!：丝：盟!：!定检测不同的基因，如前列腺癌可以检测PSAPSMAEGFR组合的mRNA。最近一项关于转移性乳腺癌的研究表明，Adna系统的CTC检出率比CellSearch系统高，但差异无统计学意义(53：47)，前者能分析CTC的表达基因C 2 3。Adna检测系统检测肿瘤细胞的mRNA容易出现假阳性，这就需要对实验设置好对照和参考值范围。13免疫磁性纳米载体在发生上皮间质转化时，CTC的表面分子表达改
9、变，EpCAM的表达率下降或不表达，这样以EpCAM为基础的检测方法会漏检CTC，因此联合多种表达分子能够提高CTC的检出率。Deng等1 0。联合使用抗一CK抗体和抗一EpCAM抗体富集的方法检测乳腺癌细胞，发现在CTC高负荷的患者中(20个75 m1)检出的CTC数量比CellSearch高15111。免疫磁性纳米载体是一种以表面金外壳和内部铁氧磁性体为主要结构的一种纳米颗粒口o，金外壳镶嵌有巯基化的聚乙二醇(PEGSH)及不同功能的连接分子，通过这些结构直接连接到特异性的抗体。之后在不同的细胞株中分别加入抗EpCAM、抗EGFR一2、抗EGFR或者抗CK抗体标记的磁性纳米颗粒。联合使用抗
10、EGFR和抗EpCAM的纳米颗粒检测A431(EpCAM+HER2一EGFR+CK+)细胞株的检出率是93，而单独使用抗EGFR抗体的纳米颗粒检出率达79。这种方法简单有效，有望成为一种便宜且有效的CTC检测方法。最近Lee等_使用复合纳米颗粒同时进行CTC捕获和原位蛋白表达分析及细胞表型分析，该方法能够捕获各种异质性的CTC，包括低表达EpCAM的细胞；不需要有机染料，不会杀死CTC；能够选择性地释放感兴趣的细胞。14快速检测法微型核磁共振是一种新的检测肿瘤细胞的方法，它由螺线管型微弹簧圈、便携式永磁铁和定制的微型核磁共振组成，能在30 min内完成检测。检测时首先分离固定预处理细胞，与TC
11、O-NHS修饰感兴趣蛋白单克隆抗体进行孵化反应，与合成的Tz-磁性纳米颗粒进行反应，最后放入线圈管内进行检测。4。联合使用抗EGFR、MUC一1、EGFR-2、EpCAM的四联抗体检测外周血CTC时，检测卵巢癌、肺癌的敏感性和特异性都在90以上。比。在操作时，首先裂解红细胞，经过离心9呼育之后就可在微型核磁共振下检测，这样减少处理的过程，可以增强检测的敏感性，提高检测效率。15核酸适体相关的检测的方法核酸适体是一种短的单链DNA或RNA寡核苷酸序列，能折叠成三维结构并且与靶分子有较高的亲和性，在体外经过指数富集配体系统进化处理过程获得，可结合的靶分子范围很广，包括胞外配体、细胞表面蛋白、化疗药
12、物、细胞毒素、小干扰RNA、纳米颗粒等。Huang等3设计了一种多价结合的金银纳米棒，多达80个荧光标记的核酸适体黏附在一个12 nm x 56 nm的纳米金属棒上，大大提高了对于肿瘤细胞的黏附力。与游离的单个核酸适体相比，这种纳米金属棒的结合能力提高了26倍，荧光强度增强了300倍，提高了核酸适体的实用价值。还有学者一1设计了不使用荧光染料的适体分析，他们直接利用具有特异结合能力的核酸适体金纳米颗粒与肿瘤细胞孵化，由于金纳米颗粒之间的等离子共振效应，当它们之问的距离小于一定程度后，吸收光谱和散射光谱都会发生改变。当核酸适-金纳米颗粒与靶细胞结合时表现出颜色变化，而未与靶细胞结合时反应物则没有
13、颜色变化，这样裸眼和比色测定都能够很好地进行辨别。因此该方法有望成为一种非常有用的床边检测方法。16磁泳技术分离CTC磁场诱导磁性微粒定向移动的技术叫做磁泳，可与黏性介质中带电粒子在外电场中作用下产生的电泳相类比，是近年来发展起来的高效、高通量生物分离技术。利用这种技术能够简单、快速、准确地分离RNA和肿瘤细胞。Kim等6。利用该原理设计了一种简单的CTC分离装置。该方法分离出的细胞保持完整性，便于进一步分析研究CTC；操作流程简单，只需要3步：只加入缓冲液；样品和缓冲液以相同的流速注入；再次加入缓冲液。这样CTC微操作的工作平台就比较容易建立并且实现自动化。此外，简单的操作步骤减少了洗脱分离
14、富集过程中的细胞损失，提高了检测的敏感性；还可以根据监测不同肿瘤的需要，使用不同的肿瘤特异性抗体和改变磁性颗粒的大小来最大化地增强对CTC的作用力，这样有利于有针对性地监测肿瘤进展情况。由于其能够和其他高端基因功能检测手段(如单细胞RTPCR技术)有机结合，因此能够进一步推进CTC自动化检测平台的发展。2纳米技术在杀灭CTC方面的运用纳米物质有独特的物理特性，如超微尺寸、高表面积比、高反应活性，这些特性使物质与构成相同的常规较大尺寸物质相比明显不同。人们能够利用这些特点去克服传统治疗和诊断的局限性。这里再介绍一些具体方法：免疫吸附促凋亡方法和纳米热疗法。纳米颗粒及埃洛石纳米管固定在基质表面上能
15、够显著提高选择素与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导万方数据圄匾旦生瘤堂盘查!Q!i生!旦筮堡!鲞筮!塑!坐Q!：!翌!Q!i：!：丝：盟!：!配体(TRAIL)结合的数量，从而提高对CTC的捕获率。TRAIL能够通过Caspase路径诱导凋亡信号，它对于恶性肿瘤细胞有不良反应而对于非肿瘤细胞无不良反应，因此可以用来设计肿瘤特异性的治疗方案。Rana等41利用仿生学方法设计了一种毛细管流室来捕获并杀灭CTC，这种毛细管流室的表面有TRAIL和E一选择素修饰，在毛细管流室流动1 h杀灭30的CTC，而静止情况下则需要4 h杀灭30的CTC。这种装置还可以选用不同的蛋白分子来捕获不同的CTC进行诱导凋亡，
16、同样的技术可以用来捕获外周血中稀有的细胞来服务于临床，这种技术若应用于临床将显著降低播散肿瘤细胞的负荷量，从而提高肿瘤治疗效果。单壁碳纳米管对7001 100 nm波长范围内的近红外线有很强的光学吸收效果，这种固有性质能够用于活细胞内纳米管的激活。单壁碳纳米管与适当的化学物质结合经近红外线照射是一种新型的药物运载和肿瘤治疗方法。Neves等纠利用蛋白质膜联蛋白V与肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞外的阴性磷脂结合的特性，设计了一种单壁碳纳米管与膜联蛋白的聚合体，在980 nm的红外线照射下，在照射1 d之内能够杀灭大部分BALBc雌性小鼠体内移植的4T1小鼠肿瘤细胞，光热疗法与环磷酰胺联合使用能提高生
17、存率。体内试验表明单壁碳纳米管一膜连蛋白V近红外辐射疗法是一种有前景的治疗方法。此外有人使用铋纳米颗粒和超顺磁性铁氧纳米颗粒结合叶酸类似物配体，之后利用x线照射杀灭CTC【16。这种靶向光动力治疗能够显著减少传统疗法的全身不良反应，但是仍有一系列的问题，需要解决之后才能运用于临床，比如纳米颗粒的毒性问题，使用之后如何使纳米颗粒排出体外等。3结语目前，CTC技术最重要的应用是实时监测接受治疗患者的CTC数量，监测病情进展、治疗及预后判断，在检测CTC方面具有非常光明的前景。此外，纳米技术还可以用来清除CTC，如果在静脉内植入纳米材料，可以直接吸附和诱导凋亡相应的CTC。体内直接处理CTC是一个非
18、常有吸引力的方向，它意味着在处理原发肿瘤的同时减少肿瘤转移负荷甚至阻断转移的发生，也意味着能够克服CTC检测过程中的一些难题。随着技术的不断改进，纳米技术的优势将会不断显示，将来可能为肿瘤的诊治发挥更大的作用。参考文献1He S，Li P，He S，et a1Detection of circulating tumour cells withthe CellSearch system in patients with advancedstage head and neckcancer：preliminary resultsJJ Laryngol Otol，2013，127(8)：788-793
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27、a1Xray enabled deteetion and eradication of circulating tumor cells with nanoparticlesJBiosens Bioelectron，2012，38(1)：348354(收稿日期：2014-0618 修回日期：2014-08-04)万方数据纳米技术在循环肿瘤细胞中的研究进展作者： 高洋， 袁周， Gao Yang， Yuan Zhou作者单位： 200233,上海交通大学附属第六人民医院普外科刊名： 国际肿瘤学杂志英文刊名： Journal of International Oncology年，卷(期)： 2015,42(1)引用本文格式：高洋.袁周.Gao Yang.Yuan Zhou 纳米技术在循环肿瘤细胞中的研究进展期刊论文-国际肿瘤学杂志 2015(1)
