1、植 物抗寒基因研究进展收稿日期： 2009-03-06基金项目： 东北农业大学创新团队项目（ C2003）作者简介： 王多佳（ 1982-），女，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为植物生理与分子生物学 。* 通讯作者： 苍晶，教授，博士生导师，研究方向为植物生理生化与分子生物学 。E-mail: cangjing2003163. com摘 要： 寒害严重影响植物的生存和分布，提高植物抗寒性，对农业具有十分重要的意义 。文章从抗冻蛋白 、冷诱导 、脂肪酸去饱和 、渗透调节物质等方面对植物抗寒基因进行归纳和总结，并对未来工作重点进行了展望 。关键词： 植物；抗寒基因；研究进展中图分类号： Q945.
2、4 文献标识码： A 文章编号： 1005-9369（ 2009） 10013406Research advance on cold-resistant gene in plants/WANG Duojia1, CANGJing1, MU Yongchao1, ZENG Yan1, XU Ping2, YU Jing1(1. College of Life Sciences, NortheastAgricultural University, Harbin 150030, China; 2. Bureau of Forestry in Zoucheng, ZouchengShandong 27
3、3500, China)Abstract: The chilling injury seriously affects plant living and distributing, hence it is important toimprove the cold-resistance of crop for agriculture. This paper reviewed the cold-resistant genes from theaspects of antifreeze protein, the cold induction, the fatty acid metabolism pa
4、thway and the osmolytes, andprospected the focus of future research.Key words: plant; cold-resistant genes; advance research寒害是农业生产中一种严重的自然灾害，不仅会限制农作物的栽种范围，也会造成农作物减产和品质下降，严重时甚至绝收 。全球每年因低温伤害造成的农作物损失高达数千亿元1。因此，植物抗寒性研究及抗寒育种一直是植物学研究领域的热点之一 。目前选育耐低温植物品种主要采用常规杂交育种的方法，即利用抗冷性品种与各种生态类型的不抗冷品种杂交，通过混合轮回选择，获得抗冷品
5、种 。经过长期研究，育种工作者已育成了不少抗寒新品种2，对避免和减少冷害损失起到了重要作用 。但是利用常规育种方法存在抗冷性资源不足 、选择周期长 、费用高等局限性，严重影响育种目标的实现，很难满足生产上对抗寒品种的迫切需要 。随着生物技术的迅猛发展，对抗寒分子机理的认识不断加深，人们开始采用基因工程手段培育抗寒新品种 。本文就近年来国内外在植物抗寒基因工程方面的研究进展进行了分析与归纳，旨在为人们进一步认识和利用植物抗寒相关基因提供参考 。1 抗冻蛋白基因抗冻蛋白（ Antifreeze Proteins， AFPs）是一类具有热滞效应和冰晶生长抑制效应的蛋白质，能以非线性形式降低水溶液的冰
6、点，但对熔点影响甚微，从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值，它们在受低温环境胁迫时能使有机体抵御冰冻环境3。1992 年，加拿大 Griffith 等首次报道从经过低温锻炼可忍受细胞外结冰的冬黑麦中发现了植物内源性AFPs4，标志着植物抗冻蛋白研究的开始 。1997年，黄永芬等采用花粉管通道法及子房注射法将美王多佳1，苍 晶1 *，牟永潮1，曾 俨1，许 平2，于 晶1（ 1. 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030； 2. 邹城市林业局林业站，山东 邹城 273500）第 40 卷 第 10 期 东 北 农 业 大 学 学 报 40(10): 1341382009 年 10 月 J
7、ournal of Northeast Agricultural University Oct. 2009洲 拟鲽 AFPs 基因导入番茄，其转基因植株的抗寒力明显增强5。Worrall 等从冷诱导的胡萝卜中纯化出一种 AFPs6，利用 CaMV35s 启动子，将 AFPs 基因导入烟草中，检测这些含 AFPs 烟草，发现能够抑制冰晶生长 。2001 年，尹明安等克隆了胡萝卜AFP 基因7，并构建了其植物表达载体，为进一步利用其转化番茄 、甜椒等作物奠定了试验基础 。2008 年，王艳等将鳖甲抗冻蛋白基因 mpAFP149转入烟草中8，低温处理 2 d，发现转基因烟草的抗冻性明显优于野生型，并
8、且当温度恢复到室温后，转基因烟草恢复生长，而野生型烟草却因受到不可逆的低温冻害而停止生长 。目前从植物中分离克隆并能够用于转化的植物抗冻蛋白基因并不多，并且不同植物的抗冻蛋白的 DNA 和氨基酸序列几乎没有同源性，因此今后关于植物抗冻蛋白基因的分离克隆将是植物抗寒基因工程研究的一个热点 。2 冷诱导基因COR（ Cold-regulated）基因是诱导合成低温诱导蛋白的一种诱发基因，只有在特定条件（主要是低温和短日照）下才得以启动和表达，进而使细胞表现出抗寒力 。在这些基因表达前，植物抗寒力仅仅是一种潜能，一种基础 。最近发现，目前已知的所有冷诱导基因都含有 CRT（ TGGCCGAC） /D
9、RE（ TACCGACAT）调控元件（ C-repeat/DehydrationResponsive Element） 。当植物遭受低温胁迫时，从感受低温信号到发生一系列具有抗寒能力的生理生化反应和调节基因表达，存在一个复杂的信号网络传导系统，转录因子调控的信号传导途径是其中的一个传导系统，其传导途径为： CBF 转录因子（ CRT/DRE Binding Factor1） CRT/DRE 基 序 COR 基因表达 植物抗寒性增加，即转录活性因子 CBF 结合到 CRT/DRE 基序上，诱导了 COR 基因表达，从而提高了植物的抗寒性9。1997 年， Stocking 等首次从拟南芥中发现转
10、录因子 CBF1 的大量表达能增强拟南芥的抗冷性10。后来人们发现拟南芥 CBF1 基因属于一个 CBF 基因家族包括 CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、CBF5 和CBF611-12，该基因家族成员均具有提高植物抗寒性的功能 。甄伟等将 CBF1 基因转入烟草和油菜基因组中，转基因油菜的抗寒性有明显提高，转基因烟草的抗寒性也有一定提高13。韦善君等将玉米泛素启动子（ Pubi）调控的 CBF1 基因转化烟草14，增强了转基因烟草的抗寒性 。金万梅等利用根癌农杆菌介导的方法将拟南芥 CBF1 基因导入草莓中15，提高了草莓对低温胁迫的抵抗力 。3 脂肪酸去饱和酶基因高等植物质膜中脂肪酸不
11、饱和度和冷敏感关系密切 。低温伤害的原初反应发生在生物膜系统类脂分子的相变上 。膜脂中的类脂和脂肪酸成分的不饱和度明显影响膜脂的相变温度 。一般认为，膜脂不饱和脂肪酸含量增高，膜脂相变温度会降低，增加了膜的流动性，从而使植物的抗寒性相应提高 。反之，冷敏感植物的膜脂相变可能是由于膜脂脂肪酸的不饱和程度较低，低温下膜脂由液晶相向凝胶相转变，造成细胞膜膜相分离，从而引起细胞代谢紊乱 。近年来，应用基因工程技术导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因，通过增加脂肪酸的不饱和度以提高植物抗寒性的研究，已经取得了突破性的进展 。1993 年， High 等筛选到一个膜脂不饱和脂肪酸突变蓝藻（ PCC6803Fad
12、12）16，并克隆了 12 去饱和酶基因 desA，转基因蓝藻 12 为不饱和脂肪酸含量增加，对低温的耐受性也明显增加，生长温度由原来的 34 降低到 5 。Somerville 等在模式植物拟南芥中获得了一系列饱和酶缺陷的突变株17，这些脂肪酸去饱和酶的突变株分别被命名为 Fad2-Fad8。Kodama 等将Fad7 基因导入烟草18，低温处理后，野生型植株生长严重受到抑制，转基因烟草生长轻微受抑 。此外，在低等原核生物蓝细菌中发现的分别编码 6、9、12 以及 -3 酰基不饱和酶基因 desD、desC、desA 和 desB 等，均具有调控膜脂去饱和作用19。这些基因通过改变植物细胞膜
13、脂磷脂组成，提高不饱和脂肪酸含量，从而增加其对低温的抗性，可以看作是植物细胞通过降低膜脂相变温度，保持液晶态膜蛋白正常功能的一种自身保护机制 。研究表明，植物叶绿体膜中磷脂酰甘油（ Phosph-atidglglycerol， PG）的脂肪酸不饱和度与膜脂相变温度及植物抗寒性关系密切20。而甘油 -3-磷酸酰基转移酶（ Glycerol-Phosphate Acyltsansferase， GPAT）又是 PG 生物合成过程中的第一个酰基酯化酶，对决定植物膜 PG 的不饱和度起关键作用 。目前，先王多佳等：植物抗寒基因研究进展第 10 期 135后 得到南瓜 、豌豆 、黄瓜 、拟南芥 、红花
14、、菠菜 、黑子南瓜 、水稻等植物 GPAT 基因的 cDNA 或 DNA片段21。Wolter 等将 GPAT 基因导入烟草和拟南芥，改变其体内磷脂酰基甘油的脂肪酸组成，提高其不饱和度，从而提高植物抗寒性22。然而，将冷敏植物南瓜 GPAT 基因转入烟草中，植株膜脂脂肪酸饱和度反而增加23。因此，想改变冷敏植物的抗寒性，可利用来源于抗冷性强的植物中的 GPAT 基因 。4 抗氧化酶活性基因低温逆境下细胞内活性氧自由基的产生使膜系统稳定性受到影响，自由基积累使膜脂发生过氧化和脱脂作用，从而破坏膜结构 。一定范围的低温胁迫下，植物可以动员其自身抗氧化防御系统清除自由基，调节膜透性及增加膜的结构和功
15、能稳定性，减少细胞伤害 。但是这种自身保护具有一定的限度，超出某一范围即会成为不可逆的伤害，最终致使整株死亡 。植物抗氧化防御系统由包括超氧化物歧化酶（ SOD） 、过氧化氢酶（ CAT） 、过氧化物酶（ POD） 、抗坏血酸过氧化物酶（ APX）和谷胱甘肽还原酶（ GR）等组成24-25。低温胁迫下这些物质协同作用以去除植物体内的活性氧自由基，其中尤以SOD 最为重要，它是植物体内第一个清除活性氧的关键抗氧化酶26。Bowler 等把烟草的 Mn-SOD 酶的 cDNA 导入苜蓿27，转基因苜蓿中的 SOD 活性增强，大田试验发现转基因植株越冬存活率也大大提高 。Liorente等从水稻中克
16、隆了与 POD 活性有关的冷诱导基因RCI328，不仅增强了植物对低温的耐受性，并且增强了对水和盐胁迫的耐受性 。5 渗透调节相关酶基因低分子质量的渗透调节物质（糖醇 、特殊氨基酸 、甘氨酸甜菜碱及脯氨酸等）的积累，可以降低植物体内的水势，从而维持体内的水分平衡 。低温胁迫时，植物通过诱导渗透调节物质的相关酶基因的大量表达，以增加这类物质的积累，维持渗透压的平衡，从而避免低温伤害 。脯氨酸是水溶性很大的氨基酸，具有较强的水合能力，在植物受到低温胁迫时，脯氨酸的增加有助于细胞的持水，防止水分散失，起到渗透调节作用 。在植物中导入糖代谢或脯氨酸代谢相关酶基因，转基因植株中糖分和脯氨酸的含量增加，增
17、强了转基因植株对水分和盐胁迫的耐受性29。甜菜碱是另一类常见的渗透调节物质，其化学性质与脯氨酸相似，它一方面通过与蛋白质的相互作用保护生物大分子在高电解质浓度下不变性，另一方面又可以作为渗透平衡物维持细胞的膨压30。王关林等将从枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）中分离克隆的基因 SacB 导入番茄中，转基因的番茄具有良好的抗寒性31。肌醇半乳糖苷酶基因催化从 UDP-半乳糖生化合成可溶性棉子糖家族（ RFO）反应的第一步32，并且在蔗糖和 RFO 的碳元素分配上起着重要的调节作用33。RFO（如肌醇半乳糖 、棉子糖等）作为一种渗透保护剂在植物的抗寒及抗旱中起了很大的作用34。
18、研究发现，在耐霜冻植物夏枯草（ Ajugareptans）和松针（ Pineneedles）中发现有大量 RFO 积累35-36。Brenac 等在对玉米种子的研究中发现，蔗糖含量的积累与抗寒和抗旱无关，而 RFO 的积累与此有关37。这就说明了在抗寒与抗旱中真正起作用的是 RFO 的比例而不是总糖的含量 。肌醇半乳糖苷酶是一种重要的代谢调控点，它的基因为研究RFO 在种子及其他组织中起渗透保护剂提供了入手点 。6 LEA（Late-Embryogenesis Abundant）蛋白基因LEA 蛋白即种子胚胎发生后期富集蛋白质，是在种子成熟和发育阶段合成的一种蛋白质，在植物受到干旱 、低温和盐
19、渍等环境胁迫后造成脱水的营养组织中大量表达38。LEA 首先在棉花中发现，后来在大麦 、小麦 、水稻 、玉米 、棉花 、葡萄种子 、大豆等作物中均检测到它的存在39。LEA 蛋白约 1030 ku，富含甘氨酸和其他亲水氨基酸 , 疏水氨基酸含量较少，具有高亲水性和热稳定性，并具有高度保守的氨基酸序列40。Xu 等将 HVA 蛋白基因转入水稻中，结果表明，转基因水稻提高了对水分胁迫和高盐胁迫的耐受性41，考虑到抗寒与抗渗透胁迫之间的关系， HVA 蛋白基因可作为一种抗寒基因加以应用 。7 展 望随着对植物抗寒分子机理的深入研究，植物抗136 东 北 农 业 大 学 学 报 第 40 卷寒 基因工
20、程取得了可喜的进展，同时也存在许多问题需要解决： 抗寒基因工程大多是围绕单个基因研究，但植物的抗寒性是由多基因控制的性状，仅靠转移 1 个基因就获得抗寒的植物比较困难，转化单基因植株抗寒性提高的程度相当有限，因此必须转移多个基因，但目前同时转化多个基因的技术还不成熟 。 ABA 与 Ca2+信号传导途径是如何系统作用将寒冷胁迫信号传递到细胞核的转录因子，转录因子又是如何调控各种抗寒基因的表达，各种抗寒基因又是如何发挥抗寒活性 , 对这些问题的分子机理研究是构成植物抗寒基因工程的基础 。只有弄清抗寒分子机理，才能有效地诱导和筛选出抗寒基因，才能有目的地导入合适的抗寒外源基因 。 有必要对植物 A
21、FPs 蛋白结构和功能进行深入的研究，以期将植物内源抗冻蛋白基因导入植物中增加协调性 。 综合对诱导基因的研究发现，许多冷诱导基因的表达具有稳定质膜结构并提高植物抗低温的作用，而这些冷诱导基因则对抗低温没有直接作用 。因此，冷诱导基因的表达产物与质膜晶态稳定性之间的相互关系成为目前抗冷分子机理研究的重要课题，它的深入研究对改进作物对低温的抗性具有重要的理论和实践意义 。相信随着分子生物学技术和方法的不断发展，用基因工程方法提高农作物的抗寒性必将取得可喜的进展，并将具有广泛的实际应用前景 。 参 考 文 献 1 邓江明 , 简令成 . 植物抗冻机理研究新进展：抗冻基因表达及功能 J. 植物学通报
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