1、Automated Flash Chromatography Applications Flash快速色谱在天然化学和有机合成的应用,Universal Technology环球（香港）科技有限公司,2,概 述,分离纯化的概念分离：混合物或混合体目的物（单体或混合物）纯化：目的物含量较高（90%）的混合物目的物单体或纯品分离纯化：去除杂质，逐步获得提高目的物 纯度或含量的过程,3,分离纯化的目的和意义,1.分子结构研究 2.生物活性研究 3.作为衍生物合成合成的原料 4.直接应用：医药、农药、兽药、植物生长活性物质、食品添加剂、化妆品、化工原料等。,4,有机化合物分离纯化的基本技术,萃取技术液
2、液萃取技术液固萃取技术 结晶与重结晶技术 色谱技术纸色谱薄层色谱柱色谱 蒸馏与精馏技术普通蒸馏减压蒸馏 精馏 干燥技术,5,TELEDYNE ISCO,Teledyne Isco 是全自动快速制备色谱技术的开创者，在1997年引入CombiFlash生产线，用于有机物提纯的全自动快速制备色谱的研发与生产，Isco最先推出多样品并行和顺序工作系统，在药物开发和天然产物领域的分离工作取得了突出的进展。,6,各种制备型液相色谱：,快速色谱 （约2 bar /30 psi） 低压液相 （ 20 bar / 300 psi）彼此压力范围会有交叠,7,制备型液相色谱的关键因素,分辨率,速度,载样量,对某一
3、个参数进行优化会影响其他分离参数：增加洗脱液的流速会降低分辨率。分辨率会因为上样量过大而下降。色谱柱的载样量又取决于柱子的直径、长度，吸附剂的颗粒度及装柱的紧密程度。,填料,提高纯化的策略,梯度选择 上样量 填料 上样方法 RediSep 色谱柱,9,O,O,N,H,O,N,M,e,O,M,e,O,O,N,H,O,N,M,e,O,M,e,Cbz-Phe-Weinreb Amide(B),Cbz-Val-Weinreb Amide(A),30% EtOAc in Heptane,Rf,A,= 0.18,Rf,B,= 0.10,Courtesy of Hoechst Marion Roussel,
4、纯化优化: 梯度的优点,10,20%,EtOAc,in,Heptane,30%,EtOAc,in,Heptane,25%,EtOAc,in,Heptane,Rf,A,= 0.18,Rf,B,= 0.098,Rf,A,= 0.13,Rf,B,= 0.08,Rf,A,= 0.09,Rf,B,= 0.026,等梯度分离,在12克柱分离后从每个收集管中取样分析,11 Pure,11 Pure Fractions,5 Pure Fractions,1 Impure,5 Pure,3 Pure Fractions,3 Impure,4 Pure,Courtesy of Hoechst Marion Rou
5、ssel,11,梯度程序对分离的影响,200 mg 样品12g 柱,连续梯度,0,5,10,15,20,25,30,35,0,10,20,30,Time (min.),% of EtOAc in,Heptane,16 个,Pure Compounds,Courtesy of Hoechst Marion Roussel,纯化优化,实例研究: 3种不同极性物质的分离,13,Isocratic 20% ethyl acetate in hexane,14,Isocratic 30% ethyl acetate in hexane,15,Isocratic 50% ethyl acetate in
6、hexane,16,Isocratic 70% ethyl acetate in hexane,17,TLC Tells Us,20% Ethyl Acetate: Top spot isolation 30% Ethyl Acetate: Second spot isolation 50% Ethyl Acetate: Bottom spot isolation,18,TLC,TLC主要回答两个问题 什么样的溶剂和固定相可以纯化该化合物？ 什么浓度的溶剂组合可以成功分离该化合物?,19,使用线性梯度洗脱,20,梯度的好处,由于物质在最佳的极性位置被洗脱，所以峰形更尖 提高了纯度 提高的色谱柱
7、上样量,21,使用梯度的原则,用TLC进行方法研究试验 选择具有最佳选择性的溶剂系统 分离前无需知道确切的溶剂系统浓度 从尽可能低的浓度开始梯度洗脱以确保不丢失目标物质,22,利用薄层 Rf 进行梯度设定,Click on “Rf to Gradient” tab,23,24,25,上样量问题,RediSep 12 g 柱的上样量,在10% 上样量时峰变宽和保留时间延长十分明显,0.5% 上样量，即 0.06g,26,色谱柱上样量,27,梯度时间 vs. 分辨率,0,5,10,15,Minutes,1 volume,2.5 volumes,5 volumes,10 volumes,20 vol
8、umes,可以控制梯度的时间（洗脱体积）以保证最高纯度的同时减少分离过程的时间,28,Suggested Method Development Process,常用分离条件-固定相和流动相的选择,29,Useful tactics:If step 1 and 2 dont show any migration, go to step 5如果采用方法1和2样品没有任何移动，则采用方法5 If step 1 and 2 show streaking spots, go to step 6如果1和2出现拖尾现象则采用6 If your compound does not absorb in the
9、UV (non-chromophore sample), go to step 5 and work at 214 nm如果1和2中没有紫外吸收，采用6选择波长214nm,Identifying Optimal Purification Conditions（方法选择原则）,30,Mobile Phase Options 流动相选择,Standard solvent systems标准溶剂系统: EtOAc/hexane or heptane MeOH/DCMConsider alternative solvent systemse可选择的溶剂系统: MTBE(甲基数丁基醚)/hexane a
10、llows 214 nm detection IPA(异丙醇)/hexane a “green” solvent system (suitable alternative to MeOH/DCM and fully compatible with silica gel up to 100% IPA),31,固定相选择,氨基取代 碱性氧化铝 中性氧化铝 酸性氧化铝 Florisil硅酸镁,氰基取代 双羟基（双醇） 强阴离子交换 (SAX) 强阳离子交换(SCX),正相硅胶 C18反相硅胶,32,RediSep 正相硅胶柱,微酸性介质 活性基团 Si-OH 氢离子很容易解离 实际活性基团Si-O-
11、 使用寿命较短，通常用于一次柱 硅胶适用于分离低-中等极性化合物，而非极性化合物在硅胶板上吸附较弱，分离较差 不同物质与固定相之间的吸附力不同；不同物质在溶剂流动相中的溶解度不同,33,正相硅胶的不足,正相硅胶的酸性 pH可能会使酸性或碱性物质的分离困难 要求对流动相进行修饰 碱性物质用TEA 酸性物质用AcOH 从TLC到柱色谱重现性不好 修饰引起额外的不便 分离前必须先更换和冲填溶剂 分离后必须去除TEA 和AcOH 用适当的溶剂进行额外的抽提和洗涤 将混合物浓缩至油状，放在真空中过夜 修饰剂可能与化合物反应,34,RediSep C-18 反相柱,用于纯化中等至高极性物质: 碳水化合物,
12、 酸性化合物, 肽类, 杂环化合物, 离子化合物 典型溶剂系统: Water/Acetonitrile, Water/Methanol 需要更长的平衡时间 流速比正相柱低 如果未变干而且保存在80%有机溶剂+20%水溶液中，可重复使用 物质的分离是依靠不同的物质在固定相和流动相之间以不同的分配系数（K）连续不断地形成分配平衡而实现的，不随流动相的移动而移动。,35,卤素取代化合物的分离,4 g RediSep正相柱 洗脱溶剂: Hexane/EtOAc,36,卤素取代化合物的分离,4.3 g RediSep C-18反相柱 洗脱溶剂: Water/Methanol,其他介质,特殊介质,38,R
13、ediSep 碱性氧化铝,碱性固定相 无需流动相修饰剂 用于纯化有碱性特性的化合物,39,RediSep 中性氧化铝,用于纯化对酸敏感的化合物,40,RediSep Amine column,氨基基团连接在硅上，取代酸基团 碱性固定相 不需使用TEA 减少了由于酸/碱反应引起的副反应 对于含有碱性组分的化合物有更好的分离效果 既可用于正相，又可用于反相条件 无需从组分中去除溶剂，减少了过程时间,41,碱性化合物的分离,4 g Normal Phase RediSep Column Solvents: Hexane/EtOAc,42,碱性化合物的分离,4.7 g Amine RediSep Co
14、lumn Solvents: Hexane/EtOAc,43,氨基取代介质,溶剂 - Hexanes, Ethyl Acetate, Methylene Chloride, Chloroform, Methanol, Ethanol, Isopropanol, Water, Acetonitrile 装样量 - 1%10% 如果目标化合物具有碱性功能基团 如果不使用时保存在异丙醇中，可重复使用,44,碱性化合物的分离,4 g Normal Phase RediSep Column Solvents: Hexane/EtOAc,45,碱性化合物的分离,8 g Basic Alumina Redi
15、Sep Column Solvents: Hexane/EtOAc,46,RediSep 强阳离子交换 色谱柱,SCX = Strong Cation Exchange 保留碱性化合物,47,碱性化合物的分离,4 g Normal Phase RediSep Column Solvents: Dichloromethane/methanol,48,碱性化合物的分离,5 g SCX RediSep Column Solvents: Dichloromethane/methanol,49,RediSep SCX 柱: 2 个可能的用途,除杂工具: 纯化含有碱性杂质的中性化合物 被吸附的碱性化合物可
16、以用含5%NH3的MeOH进行洗脱 纯化具有碱性性质的化合物,50,RediSep SAX 柱,SAX = 强阴离子交换 可结合酸性性质的化合物,51,酸性化合物分离,4 g Normal Phase RediSep Column Solvents: Hexane/EtOAc,52,酸性化合物分离,5.7 g SAX RediSep Column Solvents: Hexane/EtOAc,53,RediSep SAX column: 2 个用途,除杂工具: 纯化含有酸性杂质的中性化合物 被吸附的碱性化合物可以用含5%AcOH的MeOH进行洗脱 纯化具有酸性性质的化合物,54,RediSep
17、 氰基取代柱,当使用正相溶剂条件时，氰基取代硅胶的功能与正相硅胶相似 在反相条件下，与C-18功能相似 当用常规固定相分离困难时，可作为替代选择,55,RediSep 氰基取代柱,溶剂 - Hexanes, Ethyl Acetate, Methylene Chloride, Chloroform, Methanol, Ethanol, Isopropanol, Water, Acetonitrile 上样量 - 1%10% （大部分有机化合物）如果在纯化结束后，使用分离过程中极性最高的溶剂处理，可重复使用,56,样品,Sample,样品特性,Stationary Phase,(conditi
18、ons),Low or Medium,Polarity,Basic,Properties,High,Polarity,Acidic,Properties,Acid,Sensitive,Charged,With metal,reagent,Normal Phase Silica (NP),Amine Silica (NP/RP),Basic Alumina (NP),Normal Phase Silica (NP),Reversed Phase Silica (RP),Acidic Alumina (NP),Neutral alumina (NP),Florisil (NP),Cyano (NP
19、),Normal Phase Silica (NP),Diol Silica (NP),Cyano Silica (NP),Neutral Alumina (NP),Reversed Phase Silica (RP),Cyano Silica (RP),Reversed Phase Silica (RP),Cyano silica (RP),Metal Scavenger Silica (NP),SCX (NP),Neutral alumina (NP),Cyano silica (NP),SAX (NP),Cyano (NP),Reversed Phase Silica (RP),色谱柱选
20、择指南,57,RediSep TLC 平板,58,设计分离纯化方案前的准备工作,分离纯化方案的设计是分离纯化工作的前提，也是决定分离工作成败的关键。 方案设计前的准备工作： 查阅相关的文献资料，合理借鉴前人的工作经验。 了解待处理对象（植物材料、动物材料及反应液等）的物质组成，熟悉各种物质的理化性质。 尽可能了解目标物（被分离物质）的化学结构及其理化学性质，确立目标物可靠的检测目标物方法。 了解和熟练掌握各种分离技术，明确各方法的应用范围和优缺点 掌握有机物纯度的鉴定方法。,59,应用1: 天然产物的纯化 黄芩（Scutellaria Baicalensis）,也叫中国美黄芩（ Chinese
21、 Scullcap）或Baikal Scullcap 治疗皮肤发炎、过敏、高胆固醇和高脂脂肪的传统中药 含有类黄酮物质:黄芩苷 （Baicalin）,60,应用1: 天然产物的纯化 黄芩（Scutellaria Baicalensis）,Step 1: 总体分析信息的收集 Step 2: 大批量分离 Step 3: 在精确条件下分离未分开的峰,61,应用1: 天然产物的纯化 黄芩（Scutellaria Baicalensis）,Step 1:总体分析信息的收集 GC 分析: 含6中成分 UV 分光光度计: lmax=277 nm,62,应用1: 天然产物的纯化 黄芩（Scutellaria
22、Baicalensis）,Step 1:总体分析信息的收集 C-18 反相 TLC 薄层层析 (H2O/MeCN 1:1):,63,应用1: 天然产物的纯化 黄芩（Scutellaria Baicalensis）,Step 1:总体分析信息的收集 初步天然产物色谱:,23mg pre-coated on C-18 reversed phase Silica powder4.3g C-18 reversed phaseRediSep columnH2O/MeCN12 ml/min277 nm,64,应用1: 天然产物的纯化 黄芩（Scutellaria Baicalensis）,Step 2:
23、大批量分离,841mg pre-coated on C-18 reversed phase Silica powder130g C-18 reversed phaseRediSep columnH2O/MeCN50ml/min277 nm,65,应用1: 天然产物的纯化 黄芩（Scutellaria Baicalensis）,Step 3: 在优化条件下分离混合的峰: #1峰组,78mg pre-coated on C-18 reversed phase Silica powder13g C-18 reversed phaseRediSep columnH2O/MeCN15ml/min277
24、nm,66,应用1: 天然产物的纯化 黄芩（Scutellaria Baicalensis）,Step 3:在优化条件下分离混合的峰: #2峰组,83mg pre-coated on C-18 reversed phase Silica powder13g C-18 reversed phaseRediSep columnH2O/MeCN15ml/min277 nm,67,ISCO,快速液相制备色谱仪 快速纯化处理毫克级到百克级化学中间体的色谱系统，有效提取目标物。在更短时间内创造更多新化合物得到更纯的组分。 用线性二元梯度流动相分离有机物，收集出峰纯化物，有效改善产物的纯度。,68,ISCO
25、,进样部分 分离部分 检测部分 收集系统 控制系统 安全系统,69,ISCO,进样部分1.溶剂泵：免维护、无阀高精确计量双泵 全梯度控制更加精确流量范围：5-100ml/min连续可调 工作压力50psi 2.固体上样装置、液体上样3.四通上样阀,70,ISCO,分离部分可使用4-330g的各种色谱分离柱自动识别所装色谱柱尺寸,71,ISCO,检测器部分1.检测器和设定：紫外检测器 200-360nm可调波长，双波长扫描谱图根据斜率和阈值确定峰位置. 2.不锈钢流通池(0.1,0.5mm)，检测范围: 0.02-2.0 AUFS.,72,ISCO,收集系统 收集架可以实现连续分离，多种不同规格
26、收集架可选 可换用多种收集架，可多机并联。适用多种尺寸的试管、试剂瓶 自动转移无峰废弃物到废液瓶。 绝无溢流或脱管现象。 可按体积及峰值收集,73,ISCO,控制系统 PeakTrak操作软件，窗口界面有好操作，智能化处理选择最佳分离的各条件参数后提供预选参考程序 清晰的色码标示收集的样品和收集峰，确保准确地收集到化合物 将每个样品分离条件注释、时间和用户标识等分离数据存储在单独文件中。 完善的程序方法和数据管理及自动选择参数及结果报告，PC特定软件用于快速放大或复选分离纯化条件。 Isco发明的曲线调节形成梯度技术可迅速改变梯度，弹出窗口式操作界面方便应用，避免误操作。 先进的自动监控和强大
27、的网络通讯和超级终端功能，允许使用者通过掌上电脑或桌面个人计算机进行系统远程监控。可自动发送电子邮件来通知您工作已经完成。 USB接口便于数据的拷贝,74,ISCO,安全系统 运行过程中完全监控、配备溶剂蒸汽传感器、过压保护器和溶剂流出管，确保仪器在正常的工作环境和条件下工作，一旦出现异常自动断电保护 实验结束后，空气自动吹扫或不吹扫分离柱内残留的溶剂，避免不安全因素、环境污染和溶剂浪费。 自动确定收集器位置,75,各种样品上样技术,注射器上样 固相上样柱 直接与柱连接 干法上样,76,注射器上样,简单方便 化合物能溶解于最少的流动相中 为了提高分离效果需对柱进行预平衡,77,固相上样柱,不需
28、将样品放在柱床上 有预装柱或现成介质 可用混合介质 可进行平衡,78,直接上样,当样品不溶解时 也可用于含不溶性物质的样品 可混合介质用于专门分离,79,干法上样,可迅速净化样品 除去基线物质 省略了柱子的平衡步骤,80,柱串联叠加,困难的纯化常常要求另外的纯化或造成未分开的组分增加柱的长度可有效提高分辩率无需对介质和溶剂系统进行大的改变,81,Peak to Peak Comparison of Several Stacked 4g Columns,Teledyne Isco,柱串联,82,柱串联,Number of Columns,串联的柱数与峰分辨率的线性关系,83,3 X 4g 串联柱
29、vs单根 12g 柱的 直接比较,柱串联,84,柱串联,Case study,Hexane,85,柱串联,1 根正相柱,86,柱串联,6 根柱串联叠加,87,柱串联,柱串联是一个可以显著提高分辨率的有效工具是一个分离复杂样品的简单技术，无需对硬件或溶剂作很大改变 每增加一个柱就可以提高分辩率 可增加柱直到达到需要的分离效果,88,RediSep 色谱柱,使用方便 RFID自动识别柱子尺寸、上次使用的方法和溶剂等信息。 给出建议的梯度、流速、润柱时间 高效 重复性好 快速洗脱 低成本 介质种类多 正相 反相 C-18 特殊介质,89,RediSep 色谱柱的高生产率,更快的分离 更纯的产物 推荐
30、参数 Acetophenone/ 4-Methoxy Acetophenone Isocratic Separation 85% Hexane/ 15% Ethyl Acetate,RediSep,Competitor,90,Wide Range of Flow Rates,Flow Rate mL/min,Max Plate Counts Over Wide Range of Flow Rates,Relative Plate Counts,91,高流速,92,总结,CombiFlash 系统和 RediSep 色谱柱简化了纯化步骤、提高了终产物的纯度和总体化学家的生产率 客户调查表明：使用自动化的快速色谱设备使工作效率提高了40%,纯化手册,Free Application notes: Visit ,Thank you,
