1、激光扫描共焦显微镜技术及应用,The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy,汇报人：张杰2015年3月16日,基本介绍,中文名称： 激光扫描共聚焦显微镜 英文名称： Confocal Laser Scanning Microscopy;CLSM 定义： 利用激光点作为荧光的激发光并通过扫描装置对标本进行连续扫描，并通过空间共轭光阑（针孔）阻挡离焦平面光线而成像的一种显微镜。是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。 应用学科： 细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）,共聚焦显微镜的原理简介 （
2、Confocal Laser Scan Microscope CLSM） 从某种意义上讲，共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜，它对传统的光镜从以下几方面作了改进,在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共扼聚焦装置和检测系统而形成的新型显微镜。 利用共聚焦光路和激光扫描获得生物样品的显微断层图象，动态扫描记录、图像处理及三维立体构建、成份分析等软件。,原理简介,激光共聚焦显微镜构成,激光器 光电倍增管 检测器,显微镜 步近器,计算机 电子图像 软件,共聚焦显微镜的特点,光源 共聚焦技术 点扫描技术 信号放大 电子图像 软件,1、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波
3、束集中、波长相同。 2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。,共扼聚焦原理图,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,入射光,发射光,长通滤光片,入射光,发射光,长通滤光片,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,入射光,发射光,长通滤光片,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别,3、点与面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。 普通光镜：是在可见光源下一次性成像。
4、,4、图像信号及处理： 光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。,共聚焦显微镜的应用,高清晰成像 半定量荧光强度分析 荧光探针表达量测定 分层扫描 多种荧光标记同时检测 荧光标记物绝对定量分析 扩展应用,高清晰成像,激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。 可以清晰的表现某些细微结构。,人眼分辨率： 0.2mm光学显微镜分辨率：0.25mm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率
5、：0.18mm,牛肺动脉内皮细胞 ，微管,高清晰成像,牛肺动脉内皮细胞 ，微管,高清晰成像,鼠成纤维细胞 单克隆anti-tubulin 标记,高清晰成像,检测人类癌细胞表皮生长因子,高清晰成像,培养的293细胞绿色荧光蛋白,高清晰成像,培养的人肝癌细胞哑叮橙染色,高清晰成像,透射光扫描（DIC）,利用激光透射扫描成像，用特殊滤光片达到相差显微镜的效果，可获得清晰的具有立体感的图片,树突状细胞,培养细胞,荧光表达量测定,Sunil S et al., Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic g
6、ranule, Water Research, 42(2008)16441650,分层扫描（切片扫描）,按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。,分层扫描（切片扫描）,当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。,入射光,被检测层面,整个样品,白光（不能透过）,发射光,分层扫描（切片扫描）,较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。,分层扫描（切片扫描）,较厚层面 （平滑肌损伤可见） 较薄层面 兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。,
7、分层扫描（切片扫描）,连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。 利用专用图象处理软件，还可以实现其他许多数据分析。,植物切片三维重建,多色荧光标记检测,普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。,Mouse 3T3 cells 红色：ethidium homodimer1 ，染核 绿色：BODIPY FL phallacidin，染肌丝蛋白,牛肺动脉内皮细胞 蓝色：Hoechst 33342 染DNA 红色：PI，
8、染核仁RNA 绿色：Alexa Fluor 488 染肌丝蛋白,藤黄微球菌 绿色：活菌 红色：死菌 染色：LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit,猴胚肾细胞内弓形虫繁殖 吖叮橙染色 绿色为DNA 红色为RNA,激光共聚焦显微镜的优势,在结构方面 激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高 可实现分层扫描 可实现连续扫描，可动态记录变化 可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像 扫描速度快，对样品损伤小,激光共聚焦显微镜的优势,在应用方面 形态观察-高清晰成像 半定量-荧光强度分析 荧光探针表达量测定 定位研究-分层
9、扫描 多种荧光标记同时检测 荧光标记物绝对定量分析 扩展应用-如，FRAP法、细胞切割、细胞筛选等,激光共聚焦显微镜的优势,在效果方面 更灵敏： 共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。 定位更精确： 不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因,定量测量：,静态的定量测量对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。动态的定量测量共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分（如：钙、钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时
10、测量几种成分，并给出含量比值。,激光共聚焦显微镜的优势 在效果方面,快速性： 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。 数据图像可及时输出或长期储存： 用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。,激光共聚焦显微镜的优势 在效果方面,共聚焦显微镜应用领域,（一）细胞生物学： 细胞结构：细胞骨架，细胞膜结构、流动性、受体，细胞器结构和分布变化，细胞凋亡、细胞周期等。 （二）生物化学： 酶、核酸、荧光原位杂交、受体分析。 （三）
11、药理学： 药物对细胞的作用及其动力学分析。 （四）生理学： 膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布及其动态分析。,共聚焦显微镜应用领域,（五）遗传学和胚胎学： 细胞生长、分化，细胞组织的三维结构，染色体分析，基因表达，基因诊断 （六）神经生物学： 神经组织、细胞结构，神经递质的成分、运输和传递，递质受体，离子内外流。 （七）微生物学和寄生虫学： 细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）； （八）病理学研究及病理学临床诊断： 活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病的诊断，宫颈上皮细胞涂片诊断,Bing-Jie Ni at al., Microbial and Physicochemical
12、Characteristics of Compact Anaerobic Ammonium-Oxidizing Granules in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 76(2010) 26522656,CLSM imaging of activated sludge A (2 days of anaerobic starvation at 4 1C) (a) and sludge B (5 days of anaerobic starvation at 41C) (b).,C. Lopez et al., Evaluation of microscopic techniques (epifluorescence microscopy, CLSM, TPE-LSM) as a basis for the quantitative image analysis of activated sludge, Water Research 39 (2005) 456468,我的实验计划,微生物分布 污泥结构三维重构 污泥分层结构,
