1、铁皮石斛的组织培养研究1铁皮石斛的组织培养研究专业班级： 姓 名： 学 号： 课 程： 植物组织培养 铁皮石斛的组织培养研究2目 录摘 要 3Abstract.4前言 51.培养基 .51.1 配方 51.2 配制（以 1000ml 幼株的生根壮苗培养基为例） 61.3 灭菌 72.转接 .82.1 转接前准备 82.2 转接 82.3 培养 93.炼苗 .93.1 炼苗目的 93.2 炼苗方法 94.移栽 .104.1 基质选择 104.2 移栽技术要求 105.结论与分析 .11参考文献 13铁皮石斛的组织培养研究3摘 要 铁皮石斛( Dendrobium officinale)是兰科(
2、Orchidaceae)石斛属( DendrobiumSw)多年生草本植物。铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛是传统名贵中药材，有生津益胃、清热养阴和清咽利嗓等功效，主要药用成分石斛多糖是一种免疫调节剂。铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低。为了保护和有效利用铁皮石斛，通过组织培养技术大量快速繁殖铁皮石斛组培苗显得尤为重要。关键词：铁皮石斛 组织培养 移栽 培养基 转接 快速繁殖铁皮石斛的组织培养研究4AbstractDendrobium orchid Dendrobium is a perennial herb. It is the ultimate in
3、 DendrobiumSw,named for its ferric green epidermis.As a rare traditional Chinese herbal medicine,it contributes to dry dampness and strengthen the spleen,clear away lung-heat ,nourish yin ，clear away heat ,and so on.The main medicinal components of Dendrobium polysaccharide is a kind of immune modul
4、ators.When mature,its capsule cracks,in which seeds are in small particle size and have a low rate of natural reproduction.In order to protect and utilize the Dendrobium orchid Dendrobium ,it is particularly important to establish a rapid propagation by the tissue culture technique .key words:Dendro
5、bium orchid Dendrobium tissue cultureculture medium adapter rapid propagation铁皮石斛的组织培养研究5前言多年生草本，具有气生根。茎直立丛生、高 30-50cm，肉质稍扁，有节、有槽沟，黄绿色。单叶互生，叶片革质，无柄，狭长椭圆形或近披针形，叶鞘抱茎。总状花序腋生，每个花序有花 2-3 朵，白色，先端淡紫红色。铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物。作为我国传统的名贵中药,具有重要的药用价值。由于长期过度采挖,加之本身繁殖率低,导致其野生资源急剧减少,日趋濒危,现已被列为国家重点保护植物,成为国家重点保护的药材品种。试验结
6、果表明,MS、N6 和 B5 等 3 种基本培养基对铁皮石斛芽诱导和增殖的效果, B5 要优于其他基本培养基;在激素浓度配中,铁皮石斛原球茎在 6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L 中,增殖系数最大;天然附加物对铁皮石斛增殖的影响差异很大,实际应用中宜选用香蕉汁为添加剂;在 B5+蔗糖 30g/L+香蕉汁 100mg/L+琼脂 5.8g/L 基本培养基中,加入的 NAA 对铁皮石斛芽的生根以 1.0mg/L 处理的效果最好,但考虑到 NAA 价格较贵,且在浓度范围为 0.2-1.0 之间对生根的影响差异不明显,在实际应用中以选用 0.2mg/L 的 NAA 为好;生成的小苗经过炼苗后,
7、在铺有一层苔藓的含有 75锯末+20泥炭土+5碎磁片的基质上能够良好的生长。铁皮石斛的组织培养研究61.培养基1.1 配方根据不同阶段，培养基配方有所差异。如表 1-1表 1-1 各种培养基配方不同阶段 培养基 备注愈伤组织（原球茎）的诱导MS+2.0mg/L6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂 pH=5.8原球茎的增殖 MS+20%马铃薯+3%蔗糖+0.8% 琼脂 pH =5.8原球茎的分化 MS+20%马铃薯+2.0mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%琼脂 pH=5.8幼株的生根壮苗 MS+10%香蕉+2.0mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%琼脂 pH=5.4-5.61.2 配制（以 1000m
8、l 幼株的生根壮苗培养基为例）配方：10% 香蕉（w/w）+MS +3%蔗糖（w/w）+0.8%琼脂（w/w）+2.0mg/L NAA1）量取 800ml 蒸馏水于洁净的大烧杯中，加热至沸腾；2）准确称量 100g 香蕉果肉，切成碎片状，并倒入上述烧杯中，加热煮沸5min，其间搅拌使之充分溶解；3）按照大量、微量、Fe 2+盐、有机、有机顺序，量取 MS 各种母液于盛有 50ml 蒸馏水的烧杯，混合均匀；4）将 2）和 3）的溶液混合，然后加入 30g 蔗糖，并移取 2ml NAA（ 0.1mg/ml） ，混合均匀；5）加热至沸腾，加入 8g 琼脂并煮沸 5min，其间不断搅拌使之充分溶解；6
9、）冷却至 505时，调 pH 至 5.45.6。分装于培养瓶内，33.3ml/瓶。铁皮石斛的组织培养研究7培养基附加物：（1）天然添加物在基本培养基中加人香蕉汁、马铃薯汁、绿豆芽汁、苹果汁仁、椰子乳等能促进铁皮石斛幼苗的生长和根系的发育，香蕉汁的促进作用最为显著。（2）炭源铁皮石斛在生根培养时加入活性炭有利于试管苗的生长，能使根系长得更加粗壮闭。唐桂香等认为在培养基中添加活性炭有助于提高试管苗的成活率，但对苗的根数和根长影响小。注意事项溶解香蕉的蒸馏水尽可能多，以确保香蕉各种成分完全溶解；各种母液混合时，要按照大量、微量、Fe 2+盐、有机、有机的顺序；煮沸时，小心溶液溢出；分装时不要污染培养
10、瓶瓶口。铁皮石斛的组织培养研究81.3 灭菌1.3.1 培养基灭菌1）检查灭菌锅的水位、电源、排气阀、排气管、安全阀以及压力表，确保灭菌锅各指标和功能的正常，以防事故发生；2）把带灭菌的培养基装入锅内，盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝；3）打开电源和排气阀，调节电压至 220V；4）待排气阀排除水蒸气 30s1min 后，关闭排气阀；5）当温度上升到 121后，调节电压至 135V，保持 20min；6）关闭电源，使之自动降温至 0。10min 后，打开排气阀和锅盖；7）510min 后，取出培养基放于试验台上冷却，待用。表 1-2 灭菌时间统计多锅连续灭菌阶段 单锅灭菌（耗时 64min） 第
11、一锅（耗时63min）第二锅（耗时46min）起始 22:21 8:04 9:30排气 22:41 8:23 9:43T=121 22:50 8:32 9:50关闭电源 23:10 8:52 10:10气压降至 0 23:25 9:07 10:161.3.2 外植体灭菌原材料清洗选择生长旺盛、无病害的铁皮石斛健康植株，每 2 节为一段放入 500ml 的烧杯中，加入少量洗衣粉，用纱布单层棚扎杯口，然后用工程线扎紧，放在自来水龙头下冲洗 30min，冲水量调整到能使铁皮石斛茎段在水中漂动为好。主要作用是洗去外表尘土和大颗粒菌落、菌丝等。材料二次消毒灭菌将上述完成后的材料带到无菌室超净工作台上，进
12、行二次消毒灭菌: 将茎段腋芽的苞叶拨去。70% 的酒精速浸 25s， 用 0.1%的升汞溶液浸泡 10min 用无菌水冲洗 5 次，灭菌过程中不断摇动烧杯使灭菌更加彻底，以去掉表面药物残留。铁皮石斛的组织培养研究92.转接2.1 转接前准备1）培养皿、镊子、剪刀等转接用具的灭菌（可以在培养基灭菌时附带） ；2）检查超净台内各种用具，及时补充酒精灯的酒精，确保用具齐全；3）放置待转接材料和待接入培养基，以“方便操作为宜”而陈列；2.2 转接1）揭去防尘膜，打开电源、通风和紫外灯，灭菌 1520min；2）关掉紫外，打开白炽灯，用 75%酒精仔细擦拭手指、指甲、材料瓶瓶盖及盖边缘、工作区等处，确保
13、“消毒”彻底；3）点燃酒精灯，用无菌镊子把材料夹取于无菌培养皿内，挑选生命力旺盛的植株用于转接；4）用无菌剪刀修去多余的根系， “双镊子”法将材料转接于新的培养基中；5）标注相关日期和品系，转至培养室培养。注意事项操作时，所有用具均不能从“核心工作区”和开启的培养瓶上面晃过，防止细菌落入而导致污染；在打开材料瓶和培养瓶后，其盖均在酒精灯外焰灼烧 3-5s，瓶口灼烧 5-10s；盖瓶盖时，亦如此操作；转接时，确保手一直在超净台内，以免带入外界细菌。2.3 培养石斛组培常用的温度为(261) 光强 1 6002 000 lx日照光 812h/d（1）组培苗在光照度为 2000lx ，温度以 22
14、为宜。(2) 在 20 一 22 时丛生芽增殖较好，温度超过 25 丛生芽就开始分化成苗。待增殖芽数量较多时，将高 12cm、带有 23 片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养。培养 30 天左右，基部开始出现 23 条约 1cm 长的白色铁皮石斛的组织培养研究10根，随后逐渐伸长，生根率达到 90以上。3.炼苗3.1 炼苗目的炼苗的主要目的是使组培苗适应外界的环境温差，湿度差以及微生物环境。3.2 炼苗方法1）将待炼苗的材料放置于欲移栽的环境，不开盖保持 4-5 天；2）半开盖保持 1-2 天后，全开盖再炼苗 2-3 天；方法（整个过程：适应期，半开瓶期，开瓶期，出瓶，洗根，浸泡，移栽或
15、框炼并移栽） 。铁皮石斛的组织培养研究114.移栽4.1 基质选择栽培的基质为火山岩 1+椰衣 2+木炭 1 的基质配比石斛兰长势最好，椰衣 1+水苔 1 和块状椰衣的基质配比稍微次之。多数树皮中含有较多的酚类物质，这对于植物是有害的，而且树皮的 C/N比值都较高，直接使用会引起微生物对速效氮的竞争作用，造成 N 素缺乏，树皮保水性能差。4.2 移栽技术要求将已经灭菌地石斛茎段，在无菌条件下切成至少带有一个茎节地茎段，接种于事先准备好的诱导芽培养基中诱导出芽。从茎尖或茎段培养得到的小苗，大多数是无根小苗，需转入 12MS 加马铃薯进行生根和壮苗培养，才能出管移栽。 铁皮石斛不宜深植，种植时根系
16、向四周均匀展开，将基质填充根部、基部必须露出，否则易造成烂根。移栽后隔 5 天再浇水效果较好。30 天内每隔 1 天喷雾 1 次，水量不宜过多，期间勿施肥，待小苗恢复正常生长后才开始常规的水肥管理。4.3 移栽后期管理 营养生长期施用氮肥较高的花多多复合肥（N:P:K=30:10:10） ，花芽分化期开始施偏重磷钾肥（N:P:K=10:30:20 ） ，其余时期施（N:P:K=15:20:25 ）以促进假鳞茎的生长，采用“薄肥多施”的原则，施肥频率为 1 次1 周，浓度为 0.1%叶面喷施，雨天不施肥。石斛生长季节应注意追肥，每年可追肥两次,第一次在春季,以促进石斛生长,第二次在秋末,既可使石
17、斛储蓄养分,又可使石斛保温过冬。可用腐熟的花生鼓、菜籽饼、过磷酸钙等加入河泥等混合物撒在根部，此外尚可用 0.050.1%磷酸二氢钾进行根外追肥。铁皮石斛的组织培养研究125.结论与分析本文以铁皮石斛为材料,通过研究不同基本培养基对铁皮石斛茅诱导和增殖的影响、不同激素浓度组合对原球茎生长影响、天然附加物对铁皮石斛茅增殖的影响、不同浓度 NAA 对铁皮石斛原球茎增殖的影响,找出适合石斛组织培养快速繁殖的方法及条件,以便更好的用于生产实践。通过本实验，有助于我们更好地掌握组织培养技术，了解铁皮石斛的组织培养特点。本试验结果表明：铁皮石斛形成的愈伤组织有群体效益，在培养容器中的分布密度和愈伤组织 0
18、.5cm2 为宜；铁皮石斛在组培增殖和生根培养过程中需添加土豆汁等辅助物质，才能使组培苗正常生长；铁皮石斛的种子是呈粉状的，从表现性来看无法用肉眼观察出种子的品质好坏，若用种子做外植体进行组培繁育，无法预计培育的后代性状是否优良。用茎段为外植体建立快繁体系则具有较多的优点（诱导时间短、发生过程简单） ，在已知母本材料遗传特性的前提下，不存在分化的组织或基本植物结构的丧失，能够较好地保持母本的生物学性状和经济性状。随着近年来中药产业的蓬勃发展，人们在不断的开发挖掘铁皮石斛药用价值，企业也为提高其经济效益，确保铁皮石斛药材原料基地的建设，盲目地进行规模化产业化生产育苗，而忽视了合理的繁育手段。一旦
19、建立组培快繁体系，繁育的后代却无法保持亲本良好特性，这样的话前期工作将毁于一旦，还会带来巨大的经济损失，所以在良种选好的前提下需选择能最大极限的保持亲本的特性高效、稳定、经济合理繁育体系来保持铁皮石斛资源达到长期有效地永续利用。本研究只在铁皮石斛法、遗传稳定性方面做了研究分析，还有待于进行组培苗成年个体差异跟踪调查，组培成品苗药物活性提取及分析等方面进行全面的、更详细的研究。铁皮石斛的组织培养研究13参考文献1 杨显志, 邵华, 周成, 等. 生物技术在药用石斛中的应用. 中草药, 2002, 33(2): 1731752 邵华, 张玲琪, 李俊梅, 等. 铁皮石斛研究进展. 中草药, 200
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