1、企 业 技 术 开 发 2009 年 10 月企 业 技 术 开 发蛋白质分离纯化和蛋白质结晶的研究方法姚知渊1,周浩鹏2,周静舫3(1.临沂出入境检验检疫局 ,山东 临沂 250100;2.菏泽学院 ,山东 菏泽 274000;3.华中农业大学 食品科技学院 ,湖北 武汉 430070)Studies on separation and purification crystallization of proteinYAO Zhi-yuan1,ZHOU Hao-peng2,ZHOU Jing-fang3（1.Technical Centre of Animal and Plant Quaran
2、tine Inspection,Linyi,Shandong 250100,China;Heze University,Heze,Shandong 274000,China;College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070,China)Abstract:In this paper,it summarized the various principles and methods of protein separation and purification,andin
3、troduced the methods and factors of protein crystallization at the same time.Keywords： protein;separation;purification;crystallization摘 要： 文章主要对蛋白质的分离纯化的各种原理和方法作了简要的概述，同时简单的介绍了蛋白质结晶的方法及影响因素 。关键词： 蛋白质 ;分离纯化 ;结晶中图分类号： Q51 文献标识码： A 文章编号： 1006-8937（ 2009） 19-0046-03收稿日期： 2009-07-11作者简介：姚知渊 (1983-)，男，山东威
4、海人，大学本科，科员，研究方向：动植物检疫 。蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构 、化学组成和生物功能的基础 。蛋白质在自然界中存在于复杂的混合体系中，而且许多重要的蛋白质在细胞中的含量极低 。要把蛋白质从复杂的体系中分离出来，同时又要防止其组成 、结构的改变和生物活性的丧失，显然是有相当难度的 。目前蛋白质的分离纯化技术的发展趋向于精细而多样化技术的综合运用，但基本原理均是以蛋白质的性质为依据的 。破碎组织细胞，提取蛋白质混合物，利用盐析法 、有机溶剂沉淀法等对蛋白质进行粗提；电泳和色谱技术则可对粗提蛋白质进行进一步的分离纯化，而且可对纯化蛋白质进行结晶和制备 。实际工作中应按不同的要求和条件
5、选用不同的方法 。1 蛋白质的分离纯化1.1 粗提1.1.1 盐析沉淀法盐析沉淀法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法 。蛋白质易溶于水，因为其分子的 -COOH、-NH2和 -OH 都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成 1100 nm 大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力 。蛋白质分子表面亲水基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解度也越大 。亲水胶体在水中的稳定因素有两个，即电荷和水膜 。因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分
6、子的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大 。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出 。1.1.2 等电点沉淀法利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点来分离蛋白质的方法，称为等电点沉淀法 。蛋白质的等电点 (pI)即蛋白质的净电荷为零时的pH 值，由于等电点时的蛋白质净电荷为零，因而失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，蛋白质分子相互靠拢 、聚集，最后形成沉淀析出 。1.1.3 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法是指有机溶剂能使蛋白质分子间极性基团的静电引力增加，与水作用能破坏蛋白质的水化
7、膜，而水化作用降低，促使蛋白质聚集沉淀 。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大 。用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降 。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度 。1.2 精提1.2.1 层析 (chromatography)离子交换柱层析 。离子交换柱层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的体系进行的 。离子交换剂有阳离子交换剂 (如：羧甲基纤维素； CM-纤维素 )和阴离子交换剂 (二乙氨基乙基纤维素 )，当被分离的蛋白质溶液企 业
8、 技 术 开 发TECHNOLOGICAL DEVELOPMENT OF ENTERPRISE2009 年 10 月Oct.2009第 28 卷第 28 卷流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH 或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来 。用此法分离纯化蛋白质，不但可以保存分离物的活性，而且分辨率较高 。凝胶柱层析 。这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术 。所指凝胶从广义上说是一类具有三维空间多孔网状结构的物质，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂
9、糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等 。把适当的凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，于柱内加入欲分离的混合物，然后用大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物质的分子大小和形状不同，在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外 。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外 。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤 、凝胶渗透过滤 、分子筛过滤等 。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析 、排阻层析等 。使分离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内 。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐 、置换缓冲液及利
10、用分子量的差异除去热源 。疏水相互作用层析 。多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面 。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力 。因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具 。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用 7 mol/L 盐酸胍或 8 mol/L 脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性 。羟基磷灰石
11、柱层析 。简称 HA，一般用于分离结构差异很小的蛋白质，在实际工业和实验室应用时候是离子交换层析 、凝胶柱层析的补充方法 。1.2.2 电泳 (electrophoresis)SDSPAGE。SDS 即十二烷基硫酸钠是阴离子表面活性剂，它能断裂分子间与分子内的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种 SDS-蛋白质复合物 。此复合物可用具有 SDS 的聚丙烯酰胺凝胶 (包括连续的和不连续的系统 )电泳进行分离，通常称为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (简称 SDS-PAGE)。可把蛋白质视为偶极离子，因此会在电场中迁移 。SDS-PAGE 能有效地把不同类型的
12、蛋白质分开的主要依据，是各种物质分子量的差异性 。因为当 SDS 与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷 。与此同时蛋白质在 SDS 作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种 SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异 。可以用已知蛋白质的分子量来校正电泳迁移率，因此可估测未知蛋白质分子的分子量 。聚丙烯酰胺凝胶电泳 。聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，电泳颗粒通过网状结构的空隙时受到摩擦力的作用，摸擦力的大小与样品颗粒的大小呈正相关 。可见样品蛋白质在电场作用下受到两种作用力，即静电引力和摩擦产生的阻力，因而大大提高了电泳的分辨能力 。
13、高效毛细管电泳 。所谓毛细管电泳是在石英毛细管中进行电泳，毛细管中充满缓冲液或凝胶 。与平板凝胶电泳相比，毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这主要是由于毛细管内径细，因此表面积与体积比大，易于扩散热量；另外电泳时电阻相对大，即使选用较高电压 (可高至30 kV)仍可维持较小的电流 。毛细管电泳同茶馆内在高电场下进行，可以缩短分析时间，并且提高分辨率 。印渍转移法 。生命大分子物质 (如蛋白质 )先经过电泳后再印迹到固相载体表面上，经过灭试剂处理后，可与相应的探针反应，接着用适当的溶液漂洗，置含底物的溶液中培养，即可显出普带 。如所用探针是放射科同位素标记物时，则应将漂洗后的载体进行放射自显影，即
14、可检测出样品中特意的成分 。1.2.3 离心 (centrifugation)速率区带离心 。速率区带法是一次分离不同类型聚合物最有效方法，是根据大小不同 、形状不同的颗粒在梯度液中沉降速度不同建立起来的分离方法 。离心前预先在离心管内装入密度梯度介质 (如蔗糖 、氯化铯 )，被分离物质的样品溶液位于梯度液的上面，在离心力的作用下样品中的各组分以不同的沉降速度沉降，当颗粒的沉降速度与密度的浮力相等时，颗粒就停留在该密度区域内，使各组分达到分离的目的 。如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容
15、量较小，只能用于少量制备 。差速离心法 。差速离心是通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下进行多次离心的方法 。差速离心一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒 。进行差速离心时，首先要选择好颗粒沉降所需要的离心力和离心时间 。离心力过大或离心时间过长，容易导致大部分或全部颗粒沉降及颗粒被挤压损伤 。2 蛋白质的结晶2.1 蛋白质结晶的基本过程蛋白质属于生物大分子，但其结晶的一般过程与盐 、姚知渊,等:蛋白质分离纯化和蛋白质结晶的研究方法47企 业 技 术 开 发 2009 年 10 月企 业 技 术 开 发有机小分子等的结晶过程一样可分为 3 个阶段进行： 形
16、成稳定的晶核； 由晶核生长为晶体； 生长结束 。2.2 蛋白质结晶的基本方法结晶的方法分 3 种：批量结晶 、蒸发扩散结晶 、液 /液扩散结晶 。批量结晶 。批量结晶是最古老和最简单的蛋白质结晶方法 。它将所要结晶的蛋白质与结晶剂按要求的浓度在实验开始时，就混合起来以达到所要的过饱和度 。实验样液的体积在 50L几个毫升左右 。由于批量结晶的样液体积较大，所以此法并不适于对最佳结晶条件的探索实验 。一种改进的方法叫微量分批结晶技术 。蒸发扩散结晶 。蒸发扩散结晶是目前最常用的蛋白质结晶方法，分悬滴法和座滴法两种 。悬滴法：液滴约2 L 含有要结晶的大分子物质 、适当的缓冲液 、结晶剂等 。池液
17、体积约 125 mL 中除不含所要结晶的蛋白质大分子外，其他成分与液滴的相同，但是其结晶剂的浓度高于液滴中的浓度 。挥发性物质水及有机溶剂的扩散不断进行，直到液滴的蒸汽压与池液的相等为止 。也就是说，池液逐步使液滴中的蛋白质分子浓度提高并导致过饱和及随后的结晶 。液 /液扩散结晶又叫自由界面结晶 。位于毛细管中的样品液约 10 L 和结晶液由于存在浓度梯度，而在界面处发生自由扩散，从而导致蛋白质溶液的过饱和及随后的结晶 。2.3 蛋白质结晶的影响因素结晶蛋白质的纯度 。获得高纯度的蛋白质是对其进行结晶的前提 。Lin 等通过采用 FPLC 快速液相色谱系统得到结晶级的蛋白质，同时发现用此法得到
18、的蛋白质进行结晶，结晶的可重复性及获得晶体的衍射清晰度都大大提高 。过饱和度 。溶液的过饱和度是蛋白质进行结晶的驱动力，其本质就是过饱和溶液的实际溶解度与饱和溶液的溶解度即该蛋白质的溶解度之间的化学势的差值 。过饱和度的高低决定了结晶过程中成核及晶体生长的快慢，从而决定了晶体质量的好坏 。温度 。温度的变化会引起蛋白质溶解度的改变 。研究表明，大多数的蛋白质的结晶是在 422温度范围内进行 。某些蛋白质的盐溶液在低温时的溶解度趋向升高，而在 PEG 及 MPD 溶剂中的溶解度随温度降低而降低 。pH 值 。蛋白质为两性物质，结晶体系 pH 值的变化对其结晶行为有着重要的影响 。对于有些蛋白质分
19、子如： E.coli 的闭环腺苷酸激酶，如果不考虑所得晶体的晶型，则结晶可在较宽的 pH 值范围内进行，但是如果涉及特定的晶型，则对 pH 值的要求非常严格，通常其波动范围不超过 1。一般来讲，越靠近最佳 pH 值，晶型越单一，所得晶体质量越高 。2.4 结晶剂对于蛋白质的结晶，结晶剂的作用主要在于对溶剂水的影响而非对蛋白质分子的影响 。一般来讲，结晶剂主要分为 6 类： 盐类，如：磷酸盐 、硫酸铵等； 高分子直链聚合物，如：聚乙二醇 PEG、聚乙烯醇 PVA、聚乙烯吡咯烷酮 PVP 等； 小分子多元醇 MPD 类，如： 2-甲基2,4-戊二醇； 有机溶剂类，如：乙醇 、甲醇 、丙酮 、异丙醇
20、 、叔丁醇等； 磺酰类染料； 去离子水 。在实际工作中，通常使用混合结晶剂以获得更好的实验效果 。2.5 压力Sazaki 等用双光束干涉仪测定了高压下的溶菌酶蛋白四方结晶及正交结晶的溶解度变化 。实验表明，随着压力的增高其正交结晶的溶解度降低，而四方结晶的溶解度增大 。可能是由于不同晶型的蛋白质分子的疏水亲水程度不同，随着压力的变化，与水的作用效果不同并反映出溶解度的变化的不同 。因此，已有越来越多的研究者开始利用压力作为蛋白质结晶过程中的一个重要的调整参数以得到目的产物 。2.6 外加物理场蛋白质分子带有不同的离子和极性基团，当施加外加电场时有可能会引起带电分子在结晶体系中的分布的变化，从
21、而导致结晶行为的变化 。Taleb 等以溶菌酶蛋白为实验对象，研究了外加电场对其结晶的影响，结果表明：在外加电场的作用下，溶菌酶蛋白的结晶成核速率较无外加电场时有所降低，但所得蛋白质晶体变大 。也有人对应用外加磁场影响蛋白质分子的结晶进行了研究，发现磁场不仅能够影响结晶速率，而且可以通过抑制或加速某一生长方向的速率来改变最终获得晶体的晶型 。3 结语蛋白质具有许多不同于无机物及小分子有机物的性质，如：静电特性，物理化学性质的不稳定性，本身带有辅基 、配体等特殊因子，从而使得蛋白质的结晶过程变得复杂 。以往的研究，多数的结果具有一定的局限性，只适用所用的实验对象，对于整个蛋白质，甚至具有相似特性的某一类蛋白质的结晶过程不具有普遍意义 。参考文献：1 夏其昌 .蛋白质化学技术研究与进展 M.北京 :科学出版社 ,1997.2 王延华 ,邹晓莉 .蛋白质理论与技术 M.北京 :科学出版社 ,2005.3 吴永革 ,金春生 .人参中蛋白质的分离纯化 J.吉林大学自然科学学报 ,1999,(2).4 孔毅 ,吴梧桐 .新型离子交换柱分离蛋白质类药物的研究 J.药物生物技术 ,2001,(1).5 苏拔贤 .生物化学制备技术 M.北京 :科学出版社 ,1998.48
