1、huZP3b177 - 348 肽段在大肠杆菌中的表达及其纯化 J .生殖与避孕 ,2004 ,24(3) :143 - 148.7 宋力雯 ,汪玉宝 ,倪崖 ,等 . 人卵透明带蛋白 ZP3a 和 ZP3b 肽段的免疫原性及其抗血清体外抑制人精子 - 半透明带结合 J .生理学报 ,2005 , 57 (6) :682 - 688.8 唐键 ,谢琪璇 ,潘善培 ,等 . 重组人卵透明带 ZP3 蛋白在毕赤酵母中的表达 J .生物工程学报 ,2003 ,19(6) :758 - 762.9 熊波 ,曹佐武 ,何柳媚 ,等 . 人卵透明带 3 基因片段 hZP3. 3 的克隆及其在毕赤酵母中的表
2、达 J .南昌大学学报 :理科版 ,2005 ,29 (2) :200 -204.10 叶志华 ,梁建庆 . 人 ZP3 基因的 RT - PCR cDNA 克隆 J .生物技术 ,2005 ,15(4) :1 - 4.11 Sambrook J , Fritsch E F , Maniatis T.Molecular Cloning : a LaboratoryManualM . 2nd ed. New York : Cold Spring Harbor Labortory Press , 1989. 12 Chapman N R , Kessopoulou E , Andrews P D
3、, et al. The polypetide back2bone of recombinant human zona pellucida glycoprotein - 3 initiates acrosomalexocytosis in human spermatozoa in vitroJ .Biochem. J ,1998 , 330 (3) :839- 845.用昆虫细胞表达系统表达人组织激肽释放酶原杨青 1 ,3 ,刘建茹 2 ,张晓丹 3 ,张志强 1 ,冯立 1 ,张丽华 3 ,张玉奎 3(1. 沈阳军区联勤部疾病预防控制中心 , 辽宁 沈阳 110034 ;2.沈阳军区联勤部大
4、连第二干休所 ,辽宁 大连 116017 ;3. 中科院大连化学物理研究所 ,生物技术中心 ,辽宁 大连 116031)摘要 :目的 :利用杆状病毒 - 昆虫细胞表达系统表达 proHUK,系统优化表达条件。 方法 :用改进的方法对昆虫细胞进行了无血清悬浮适应培养 ,用 ELISA、 SDS - PAGE方法对各种条件下 proHUK的表达量进行检测。 结果 :Sf - 9、 Hi - 5 细胞在血清减量速度为 5 %、 1 % ,接种密度分别为 2 106 cellsPmL、 1 106 cellsPmL 时能很快适应无血清悬浮培养。在病毒感染复度 MOI为 10 ,细胞接种密度为 1 10
5、6 cellsPmL 条件下培养 96h 后 ,proHUK的表达量最高可达 30mgPL。 结论 :改进的方法使昆虫细胞能更快适应无血清悬浮生长条件 ,获得了高表达 proHUK的方法 ,为其大规模制备奠定了基础。关键词 :组织激肽释放酶原 ;昆虫细胞 ;表达中图分类号 :Q786 文献标识码 :A 文章编号 :1004 - 311X(2006) 06 - 0007 - 03Expression of Human Tissue Prokallikrein in Insect CellsYANG Qing1 ,3 ,LIU Jian - ru2 ,ZHANG Xiao - dan3 ,ZHAN
6、G Zhi - qiang1 ,FENGLi1 ,ZHANGLi - hua3 ,ZHANG Yu - kui3(1. Center for Disease Control and Prevention of Shenyang Command , Shenyang 110034 , China ;2. Dalian Second Rest - home of Shenyang Command ,Dalian 116071 , China ;3 . Center of Biotechnology , Dalian Institute of Chemical Physics , Chinese A
7、cademy of Sciences , Dalian 116011 , China)Abstract :Objective : Using baculovirus - insect cell system to express human tissue prokallikrein. To obtain the optimal expression conditions forthe recombinant prokallikrein. Methods : A new method was developed to reculture insect cells. The expression
8、level was detected by ELISA andSDS - PAGE. Results : The cells were recultured in medium without FBS , and further suspended in a spinner flask. The expression level ofrecombinant prokallikrein under MOI = Z10 , cells inoculating density 1 106 cellsPmL conditions was as high as 30mgPL. Conclusion :A
9、 newmethod to obtain high expression level prokallikrein was developed.Key words :tissue prokallikrein ; insect cell ; expression收稿日期 :2006 - 09 - 14 ;修回日期 :2006 - 10 - 24作者简介 :杨青 (1968 - ) ,女 ,博士 ,助研 ,从事蛋白质表达及分离纯化研究 ,曾获军队科技进步三等奖等 ;张玉奎 (1943 - ) ,男 ,中科院院士 ,博士生导师 ,分析化学家。人组织激肽释放酶 ( HUK) 属于丝氨酸蛋白酶的一个亚类
10、,在人体内发挥着调节血压、改善组织缺血等重要生理作用。近年来基础研究显示其对肾脏细胞具有特殊的保护作用。因此对其进行开发应用研究 ,弥补目前在肾脏病治疗上的不足很有意义 1 。但由于无法获得充足、价廉、安全的组织激肽释放酶 ,目前的研究都局限于腺病毒表达的 HUK在模型动物上的应用 2 ,3 。而腺病毒表达的蛋白在临床应用上存在着极大的风险 ,仍然为国际社会所禁止。 HUK在体内主要是以组织激肽释放酶原 (proHUK) 的形式存在。本文探讨了用杆状病毒 - 昆虫细胞系统表达 proHUK,提出了一种适用于昆虫细胞的无血清悬浮适应新方法 ,并对 proHUK的表达条件进行了优化 ,为大规模制备
11、提供了应用基础。1 材料与方法1. 1 材料1. 1. 1 实验材料25cm2 、 75cm2 、 150cm2 细胞培养瓶 ,美国 Hyclone 公司 ;胶头滴管、移液管、塑料枪头等 ,江苏海门三和培生玻璃器材公司 ;Hi - 5 细胞 (粉纹夜蛾 Trichoplusia ni 的卵巢组织细胞 ) 、 Sf - 9细胞 (草地贪夜蛾 Spodoptera frugiperda 的卵巢组织细胞 ) 、重组杆状病毒 (pAd. CMV - cHUK)由美国南卡医科大学赵立教授提供。1. 1. 2 试剂NaCl、 NaH2 PO4 、 Na2 HPO4 ,分析纯 ,国药集团化学试剂有限公司 ;
12、NaOH ,分析纯 ,齐齐哈尔化工总厂 ;考马斯亮蓝 R250 ,Fluka 进口分装 ,华美生物试剂有限公司 ;溴酚蓝 ,分析纯 ,上海试剂三厂 ;胎牛血清 (FBS) 、二甲基亚砜 (DMSO) 、 Pluronic F68 ,美国 Sigma - Aldrich公司 ;实验中所用水均为 SG超纯水。1. 1. 3 仪器 : HERAcell 培养箱、 Megafuge 1. 0R 低温水平式离心机 ,德国 Kendro 实验器材公司 ; XDS - 1 倒置相差生物显微镜 ,重庆光电仪器总公司 ;Ultra Clear 系列超纯水系统 ,德国 SG水处理及再生技术公司 ;Cellgro
13、S45625 旋转仪 ,美国 BarnsteadThermolyne 公司 ;移液枪 ,瑞士 Bioscience AG公司。1. 1. 4 培养基 :HyQ CCM3 培养基 ,美国 Hyclone 公司。1. 2 方法1. 2. 1 昆虫细胞的复苏 :昆虫细胞按参考文献 4 的方法进行复苏 ,培养基使用 HyQ CCM3 ,内含 10 %FBS。1. 2. 2 昆虫细胞的冻存 :在 75cm2 培养瓶中 ,取对数生长期的细胞 ,用移液管吸弃原有的培养基 ,加入约 5mL 新鲜培养基。用胶头滴管从平底开始将细胞吹起 ,并轻轻吹打细胞使其均匀悬浮。取少量细胞计数 ,并测定其活率。如果活率 95
14、 % ,则用内含 7. 5 % DMSO 和 10 % FBS的培养基将细胞稀释成密度为 5 106 cellsPmL 的细胞悬液。将细胞悬液移入冻存瓶中 ,每瓶 2ml。将冻存瓶依次摆入周围放有棉花的小盒中 ,置 -70 冰箱中。 12h 后将冻存瓶移入液氮罐中长期存放。1. 2. 3 昆虫细胞的无血清悬浮适应 :昆虫细胞在内含 10 %FBS的培养基中贴壁培养 ,进入对数生长期后进行无血清适应 ,即在细胞传代时使用内含 5 %FBS的培养基 ,接种密度 2 106 cellsPmL。 24 48h 后传代 ,换内含 1 %FBS 的培养基 ,接种密度 1 106 cellsPmL。待细胞长
15、满整个瓶底后用无血清培养基传代 ,继续培养 ,直至细胞适应无血清生长状态。昆虫细胞适应无血清生长状态后将其以 1 1. 5 106 cellsPmL 密度接种于旋转培养瓶中 ,其中加入 0. 5 %Pluronic F68 ,细胞密度超过 3 106 cellsPmL 后传代 ,减少 Pluronic F68 的使用量 ,直至全部去除。1. 2. 4 昆虫细胞的感染 :对数生长期生长的贴壁 Hi - 5 细胞第 16 卷第 6 期 :72006 年 12 月 生 物 技 术BIOTECHNOLOGY Vol116 ,No16 :7Dec12006 1994-2007 China Academi
16、c Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/以 1 106 cellsPmL 接种于培养瓶中 ,在旋转仪上以 86 rPmin 的速度旋转。在 27 下培养 24h 后计数、测活率。之后每 24h 计数、测活率。如果细胞数超过 3 106 cellsPmL ,活率小于 95 % ,则将细胞以 1 106 cellsPmL 传代。在相同条件下继续培养 ,直到细胞计数达到 2. 5 3 106 cellsPmL ,细胞活率超过 95 %。以MOI = 10 高感染复度加入重组杆状病毒。在相同条件下继续培养。 9
17、6h 后收获感染上清液 ,置 - 4 贮存备用。1. 2. 5 细胞计数及活率测定 :细胞的计数及活率测定按参考文献 4 的方法进行。2 结果2. 1 培养条件对细胞生长状态的影响昆虫细胞适应含血清贴壁培养条件。进行无血清悬浮适应时 ,如果血清减量太快 ,则会对细胞生长造成危机 ,使细胞快速死亡。所以常用的方法都是缓慢降低血清用量 ,一般细胞要传代 4 5 次才能适应。这样做成本高 ,容易污染。通过大量实验 ,我们摸索到 1. 2. 3 节中使用的血清减量方法。细胞在这种条件下适应 ,几乎没有危机期 ,传代 2 3 次即可适应无血清生长条件 (图 1) 。加入含有 proHUK cDNA 的重
18、组杆状病毒 48h 后 ,细胞即出现明显的感染症状 ,胞体肿大 ,胞膜粗糙变薄 ,内含大量黑色颗粒状物质。 144h 后细胞开始溶解。图 1 昆虫细胞无血清悬浮适应细胞密度与活率随时间变化Figure 1 Viable cell density and viability of insect cell in suspension culturewithout FBS2. 2 有血清和无血清培养对 proHUK表达的影响杆状病毒 - 昆虫细胞系统表达的 proHUK为外泌蛋白 ,主要存在于细胞培养上清液中 ,因此利用细胞培养上清液来分离纯化目标蛋白。从 SDS - PAGE检测结果可以看出相对于
19、细胞表达的 proHUK来说 ,培养基中存在的血清是非常大量的 ,给下游的分离纯化带来很大的困难。在这一步将细胞进行无血清悬浮适应后 ,去除了培养细胞时使用的大量血清 ,不但减缓了下游分离纯化的压力 ,提高了单位体积培养基内 proHUK的含量 ,而且降低了成本。 ELISA 检测结果显示 ,细胞适应无血清悬浮培养条件后 ,proHUK的表达量并无改变 (图 2) 。图 2 血清去除前后 proHUK表达量对比Figure 2 The proHUK expression level with and without FBS2. 3 不同接种密度对 proHUK表达量的影响用 ELISA 方法检
20、测了在各种不同的接种密度下重组 pro2HUK的表达量 ,结果如图 3。由图可见对数生长期的昆虫细胞以密度约为 1 106 cellsPmL 接种 ,并感染病毒结果最佳。细胞密度太稀单位体积培养基中所含的表达蛋白的量较低 ;太密则细胞生长除受到病毒影响外还受到自身抑制 ,使 proHUK的表达受到限制。2. 4 不同病毒感染复度 (MOI) 及培养时间对 proHUK表达量的影响病毒感染复度对目标蛋白表达量的影响见图 4。通过条件实验 ,以 MOI = 10 的感染复度接种重组杆状病毒 ,将细胞培养 96h 后 ,目标蛋白的表达量最高。延长培养时间目标蛋白表达量反而略有下降。因此 ,感染后培养
21、 96h 即可收获细胞培养上清液 ,不必再延长培养时间。图 3 不同接种密度与 proHU 表达量间的关系Figure 3 The relationship between inoculating density and proHUK expressionlevel图 4 不同感染复度下 proHUK表达量与培养时间的关系Figure 4 The relationship between proHUK expression level and incubatingtime under different MOI3 讨论昆虫细胞表达系统具有很多大肠杆菌表达系统无法比拟的优点 ,因此近年来常用于表
22、达人体内的各种蛋白质 5 ,6 。昆虫细胞通常在含有胎牛血清的环境下贴壁培养。但贴壁培养限制了单位体积培养基中细胞的密度 ,影响目标蛋白的表达量。同时 ,培养细胞时所使用的血清也给目标蛋白的下游分离提纯造成极大的压力。因此 ,应用细胞进行大规模表达制备重组蛋白一般都对细胞进行无血清悬浮适应。但目前的方法血清减量速度慢 ,耗时成本高 4 ,7 。本文提出了一种改进的适应方法 ,通过对血清减量速度和接种密度的匹配 ,使昆虫细胞在 FBS含量分别为 5 %、 1 % ,接种密度为 2 106 cellsPmL、 1 106 cellsPmL 条件下能够很快适应无血清悬浮生长条件 ,为基因工程 pro
23、HUK的大规模制备提供了方便条件。在病毒扩增及蛋白表达时 ,本文没有采取常用的感染过8 生 物 技 术 第 16 卷第 6 期 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/程 ,即接种细胞后先让细胞沉降 ,然后将培养基吸出 ,加入病毒 进行感染 ,最后再加入新鲜的培养基进行培养。而是将重组杆状病毒与昆虫细胞同时加入到培养瓶中 ,这样操作减少了污染机会 ,节约了培养基 ,同时也节省了时间。实验结果表明这种操作方便可靠 ,不影响蛋白的表达量。对病毒感染复度的考查结果
24、表明 proHUK表达量在 MOI = 10 时最高 ,分析原因可能是 MOI过低时 ,细胞没有全部在第一时间感染上病毒 ;而 MOI过高时 ,则细胞感染过度 ,生长受到过度抑制 ,造成蛋白表达量低。昆虫细胞感染重组病毒后 ,培养 96h ,培养基上清液中 proHUK的含量最高 ,继续培养 proHUK的含量反而略有下降。这可能是此时已经有部分细胞开始溶解 ,释放出各种胞内蛋白酶 ,造成蛋白水解。在本文条件下 ,proHUK的表达量可达 25 30mgPL ,明显优于已有的报道 8 。参考文献 : 1 Zhang J J , Bledsoe G, Kato K, et al. Tissue
25、kallikrein attenuates salt - in2duced renal fibrosis by inhibition of oxidative stressJ .Kidney Internation2al. ,2004 , 66 (2) : 722 - 732. 2 Puddu GM , Cravero E , Ferrari E , et al. Gene - Based Therapy for Hyper2tension - Do Preclinical Data Suggest a Promising Future ? J .Cardiology ,2006 Sep12
26、,108 (1) : 40 - 47.3 Bledsoe G, Chao L , Chao J . Kallikrein gene delivery attenuates cardiac re2modeling and promotes neovascularization in spontaneously hypertensive ratsJ .American Journal of Physiology , 2003 , 285 (42) : H1479 - 1488.4 Guide to baculovirus expression vector system( BEVS) and in
27、sect cell cul2ture techniques. GibcoBrl Instruction Manual. Invitrogen life technologies.2005. www. invitrogen. com.5 Dalemans W. Insect cells as a new substrate for vaccine productionJ .DevBiol ( Basel) . ,2006 ,123 : 235 - 41.6 Ian Hunt. From gene to protein : a review of new and enabling technolo
28、giesfor multi - parallel protein expression J .Protein Expression and Purifica2tion , 2005 , 40 : 1 - 22. 7 Vivian C , Kim C , Carleen P , et al. Purification and characterization of hu2man - derived Pneumocystis jirovecii dihydrofolate reductase expressed in Sf21insect cells and in Escherichia coli
29、 J .Protein Expression and Purification ,2005 , 40 : 417 - 423.8 Lu H S , Hsu Y R , Narhi L O , et al. Purification and characterization ofhuman tissue prokallikrein and kallikrein isoforms expressed in Chinese hamsterovary cellsJ .Protein Expression and Purification ,1996 , 8 :227 - 237.凋亡素融合蛋白的可溶性
30、表达及活性分析张英波 ,王春艳 ,郝军元 , 张玉静 3(吉林大学农学部畜牧兽医学院 ,吉林 长春 130062)摘要 :目的 :构建 PET - 28a - SPA 原核表达载体 , 在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中实现其高效可溶性表达 ,测定对肿瘤细胞的凋亡效果。 方法 :本实验在获得凋亡蛋白融合基因的基础上 ,成功地构建了重组表达质粒 PET - 28a - SPA ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 BL21(DE3)感受态细胞中 ,经 IPTG诱导表达 ,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和 Western blot 检测 ,并采用 MTT法检测其对肿瘤细胞的增殖抑制。 结果 :表达产
31、物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ,凋亡蛋白融合基因获得高效表达 ,软件分析表明表达蛋白占菌体蛋白 20 %左右。上清表达量约为 10 %。上清蛋白经纯化后 , Western blot 结果显示 ,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合 ,并且对 A549 肺癌细胞及 Hela 细胞具有一定的凋亡作用。 结论 :所获凋亡蛋白以高效胞质可溶形式表达 , 为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。关键词 :凋亡蛋白 ;融合基因 ;可溶性表达中图分类号 :Q786 文献标识码 :A 文章编号 :1004 - 311X(2006) 06 - 0009 - 03Soluble E
32、xpression and Activity Analysis of Apoptin Fusion ProteinZHANG Ying - bo , WANG Chun - yan , HAO Jun - yuan , ZHANG Yu - jing3(College of Animal and Veterinary Medicine ,Jilin University ,Changchun 130062 China)Abstract :Objective :To construct the recombinant expression vector of pET - 28a - SPA an
33、d to soluble expression highly in cytoplasmic fraction inE. coli BL21(DE3) , examine the cytotoxicity of the purified products against the cancer cells. Methods :Recombinant expression plasmid pET -28a - SPA was constructed according to recombinant plasmid. The correct recombinant expression plasmid
34、 was transformed into the host strainBL21 (DE3) induced by IPTG. The specific protein expressed was detected by SDS - PAGE and Western blot ,the cytotoxic ability of the purifiedproducts were examined by MTT. Results : The specific protein expressed was detected by SDS - PAGE. The fusion protein was
35、 expressed at highlevel amounting to 20 % of the total bacterial protein analyzed by computer software. The amount in supernatant is about 10 %. After purified thesupernatant protein ,Western blot showed the monoclonal antibody raised against the recombinant Apoptin in murines could react to the pro
36、tein ex2pressed specifically , and exerted cytotoxic effect on A549 and Hela cancer cells. Conclusions : The fusion protein was expressed highly in cyto2plasmic fraction in BL21(DE3) , and as soluble form in E. coli BL21(DE3) . Supporting that it would be a promising candidate for tumor targetedimmu
37、notherapy.Key words :apoptin ; fusion gene ; soluble expression收稿日期 :2006 - 07 - 20 ;修回日期 :2006 - 10 - 17基金项目 :国家自然科学基金项目资助 (“肿瘤的发生和端粒酶活性变化的相关性研究” ,30170694)作者简介 :张英波 (1980 - ) ,男 ,硕士生 ,从事分子生物学研究 ; 3 通讯作者 (Corresponding anthor) :张玉静 (1941 - ) ,女 ,教授 ,博士生导师 ,中国农业生物化学学会理事 ,吉林省生物化学学会副理事长 ,发表论文 100余篇 ,出
38、版著作 12 部 ,主持国家自然基金课题 2 项、省部级课题 2 项。凋亡蛋白 (apoptin)是由鸡贫血病毒 (CAV) VP3 基因产生的蛋白质 ,能够选择性的诱导肿瘤细胞的凋亡 1 ,这种由凋亡蛋白诱导的凋亡不依赖功能性 P53 的生成 ,也不被 BAG 1、 BcrabL 的生成所抑制 ,甚至不受凋亡抑制因子 BcL 2 过量产生的影响 2 。 I. K. H. Poon 等 3 将绿色荧光蛋白 ( GFP) 基因与凋亡蛋白基因融合 ,转染真核细胞 (COS - 7 和 SAOS - 2) ,荧光定位于细胞核 ,表明凋亡蛋白的作用靶点位于细胞核。这些特性预示 ,凋亡蛋白可被用作一种治
39、疗因子。目前 ,人们正在试图寻找具有靶向性强 ,特异性高及对正常组织器官无明显伤害作用的药物来治疗恶性肿瘤。生长抑素 (somatostatin SS)有广泛的抑制作用 ,可以抑制肿瘤的增生。生长抑素受体(SSTR) 广泛存在于许多正常人体组织器官中 ,而且 ,多种肿瘤细胞系亦有 SSTR 的高密度表达。因此我们将对肿瘤细胞具有很高亲和性的生长抑素基因 (SS) 和在转膜过程中发挥主要作用的绿脓杆菌外毒素 A 区基因定向地连接在凋亡蛋白基因的 5端 ,从而使凋亡蛋白更加精确定地定位于肿瘤细胞周围使其发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。同时为探讨凋亡蛋白融合基因在大肠杆菌中的表达情况 ,我们利用基因工程重组技术成功地获得了凋亡蛋白融合基因原核表达产物 ,经纯化后 ,应用 western blot 检测到特异性表达带与抗体的结合 ,并对凋亡蛋白融合基因表达产物的活性进行了初步检测。1 材料和方法1. 1 材料1. 1. 1 材料第 16 卷第 6 期 :92006 年 12 月 生 物 技 术BIOTECHNOLOGY Vol116 ,No16 :9Dec12006 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/
