1、CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术 本文主要从 CRISPR 研究历史、作用机理以及 CRISPR/Cas 在定点修饰中的应用等方面介绍 CRISPR/Cas9 的研究进展。 1 CRISPR 研究历史 1987年，日本课题组在 K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列 1， 随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组 ，2002 年 ， 科 学 家 将 其 正 式 命 名 为 clustered regularly interspaced shortpalindromicrepeats(CRISPR)2-4。因为缺乏病毒和质粒的序列信息，初期对CR
2、ISPR 的研究进展缓慢，其行使的确切功能一直未能阐明。 2005 年，三个研究小组均发现 CRISPR 的间隔序列 (spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关 5-7。2006 年，美国研究小组通过生物信息分析预测， CRISPR 系统可能以类似于真核生物的 RNAi式行使其免疫功能 8。但这些都只是假设。 2007 年， Barrangou 等9首次发现并证明细菌可能利用 CRSPR 系统对抵抗噬菌体入侵 。 2008 年 ，Marraffini 等 10 又发现细菌 CRISPR 系统能阻止外源质粒的 转移，首次利用实验验
3、证了 CRISPR 系统的功能，由此科学家们揭开了研究 CRISPR 系统作用机制的序幕。之后研究人员很快发现 CRISPR 系统在食品发酵工业和医学中的潜在价值，使其成为研究的热点。 2 CRISPR/Cas 的基因座结构 CRISPR/Cas 的基因座结构相对简单 ( 图 1) 。以产脓链球菌(Streptococcuspyogenes SF370)的典型 Type CRISPR/Cas 为例， 其基因座结构可分别三部分， 5端为 tracrRNA 基因，中间为一系列 Cas 蛋白编码基因，包括 Cas9、 Cas1、 Cas2和 Csn2， 3 端为 CRISPR 基因座， 由启动子区域
4、和众多的间隔序列 (spacers)和重复序列 (direct repeats)顺序排列组成 3 CRISPR 的分布与分类 CRISPRdb 和 CRISPI 是两个专门收录 CRISPR 信息的数据库， CRISPRdb 中包括一些识别和分析 CRSPR 的软件工具，数据库由巴黎大学维护 (http：/crispr.upsud.fr) 11-12。 CRSPI 中含有 Cas 蛋白和 CRISPRs 的数据，补充了CPRISPRdb 的数据 (http： /crispi.geneouest.org/)通过对数据库中的 CRISPR 序列信息分析发现，接近 90%的古细菌和 40%的细菌的基
5、因组或是质粒中至少存在一个 CRISPR基因座 13。 CRISPR 中的高度可变间隔序列主要来源于噬菌体或是质粒，长度范围在 21 72 bp，不同的 CRISPR 基因座包含的间隔序列的数量差异很大，从几个到几百个不等。目前发现间隔序列数量最多的 CRISPR 存在于一种黏液细菌 (Haliangium ochraceum DSM 14365)中，包含 587个间隔序列14 CRISPR中的重复序列长度范围在 21 48bp，序列并非严格保守，甚至在同一个细菌内的不同 CRISPR 基因座的重复序列也有不同，但它的 5 端和 3端部分为保守序列，分别为 GTTT/g 和 GAAAC。重复序
6、列里还包含部分回文结构， 转录出的 RNA能形成稳定且保守的二级结构，可能在与 Cas蛋白结合形成核糖核蛋白复合物的过程中发挥重要作用 4, 14-16。通常在临近 CRISPR 基因座的区域还包含一组保守的蛋白编码基因，被称为 Cas基因，它们编码的蛋白包含核酸 酶、聚合酶、解旋酶以及与核糖核酸结合的结构域 27。这些 Cas蛋白与 CRISPR 转录出的 RNA结合形成核糖核蛋白复合物协同行使 CRISPR/Cas 系统的免疫功能。一般认为临近区域有 Cas基因的 CRISPR 基因座是有活性的，反之被认为 Fig. 1 Schematic of CRISPR/Cas9 mediated
7、DNA double-strand break 图 1 产脓链球菌 CRISPR/Cas9 干扰噬菌体或外源质粒入侵示意图 是无活性的 CRISPR基因座。但这种现象并不是绝对的，如果同 一个细菌基因组中有多个 CRISPR 基因座，即使部分 CRISPR 基因座附近不包含有 Cas 基因，它也能够被转录并与基因组其他位点的 Cas基因编码蛋白结合，所以依然可以发挥功能 16,18-19。因为 Cas基因多样性异常丰富，简单的分类很难区分那些同源但功能并不相关的 Cas蛋白 20 。多个研究小组共同提议，考虑多个因素，包括保守性的 Cas 蛋白之间的进化关系及 Cas 基因操纵子的组成方式等，
8、 CRISPR/Cas的免疫机制分为相对独立的层次：第一个层次主要是对外来信息 的处理和加工，形成免疫记忆，也就是新的间隔序列的获得，主要由通用的核心蛋白 Cas1和 Cas2参与完成；第二个层次主要为初级 CRISPR RNA 成熟以及识别和降解入侵的外源遗传物质。 按照该分类标准可以将 CRISPR/Cas系统分为： Type 、 Type 、 Type 三种不同类型。 Type 系统是 CRISPR/Cas 系统中 Cas 蛋白最多和最复杂的系统，包含 6 个蛋白，其中有特征性的 Cas3 蛋白，该蛋白具有解旋酶和核酸酶功能 21。多个 Cas蛋白与成熟的 crRNA共同结合形成 CRI
9、SPR 相关病毒防御复 合物 CASCAD(CRISPRassociated complex for antivirusdefense)， CASCAD与入侵的外源 DNA结合，促使 CASCAD内的 crRNA与外源 DNA 的互补链配对形成 R 环结构， Cas3 的核酸酶识别 R 环结构后先将互补链切开，随后在 Cas3的解旋酶和核酸酶作用下再将非互补链切开 22-24。 Type 系统的主要特征是包含一个标志性的 Cas9 蛋白 (分子质量很大的多功能蛋白 )参与 crRNA 的成熟以及降解入侵的噬菌体 DNA 或是外源质粒 25。 Cas9 蛋白包含两个功能结 构域，一个在 N 端，
10、有类似于 Ruc 核酸酶的活性，一个在中部有类似 HNH 核酸酶的活性。嗜热性链球菌具有典型的 Type CRISPR/Cas 系 统 ， 它的 CRISPR/Cas系统编码tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指导 RNase 和 Cas9 完成前体 crRNA 的成熟。 随后 tracrRNA 还能与成熟的 crRNA的重复序列配对形成 RNA二聚体，进而和 Cas9 蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源 DNA功能 26。 Type 系统包含特征性的 Cas10 蛋白 ， 其具有 RNA 酶活性和类似于Type 的 CASCAD 功能 27。
11、 Cas10 主要参与 crRNA 的成熟和剪切入侵外源 DNA。目前发现 Type 有两种亚型： Type A 和 Type B。激烈热球菌的 CRISPR/Cas 系统属于 Type A 型，它干扰的靶标是 mRNA28；表皮葡萄球菌 CRISPR/Cas 系统属于 Type B 型，它的靶标与 Type 和 CRISPR/Cas 系统相同，是 DNA10。这也反映了自然界中的 CRISPR/Cas 系统的多态性。三种类型的 CRISPR/Cas 系统的分布有所不同。 Type 系统在细菌和古细菌中都有发现；Type 系统仅存在于细菌中； Type 型大多存在于古细菌中，只有少数的细菌是T
12、ype 型 29。 20 世纪 90 年代末期测序技术开始飞速发展，越来越多的细菌和古细菌的基因组信息被解密，科学家们发现一些特殊的菌株中同时存在多种类型的 CRISPR/Cas 系统，推测基因的水平转移可能是导致这一现象的主要原因，例如一些包含有 CRISPR/Cas 系统的质粒、转座子元件，在不同的菌株之间的转移 14,18-19,30。 4 CRISPR/Cas作用机制 对于 CRISPR/Cas 的作用机理可以分为三个阶段来理解，第一是 CRISPR 的高度可变的间隔区的获得，第二是 CRIPSR 基因座的表达 (包括转录和转录后的成熟加工 )，第三是 CRISPR/Cas 系统活性的
13、发挥或者是对外源遗传物质的干扰。CRISPR 的高度可变的间隔区 (spacer)获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒 DNA 的一小段 DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于 CRRSPR的 5 端的两个重复序列之间 (repeats)。因此， CRISPR 基因座中的间隔序列从 5 到 3 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为 protospacer，通常 protospacer的 5 或是 3 端延伸几个碱基序列很保守 ， 被称为 PAM(protospacer adjacent motifs)，它的长度一般为 2 5 碱基
14、，一般与 protospacer 相隔 1 4 碱基 31。 新间隔序列的获得可能分为三步：首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA潜在的 PAM，将临近 PAM 的序列作为候选 protospacer；然后在 CRISPR 基因座的 5 端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间。目前只有第一个步骤被证实， Cas1 和 Cas2 蛋白是负责新间隔序列获得的核心蛋白 9, 32。另外研究发现 Type 型 CRISRP/ Cas系统中 Csn2蛋白对于新的间隔序列的获得也是必需的 9,33。多个研究表明 CRISPR基因座首先被转录成前体 CRISPR RNA(pre-crRNA)，
15、然后在 Cas 蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的 RNA 单元，这些小 RNA 即为成熟 crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成 33-38。 Type 型 CRISPR/Cas 系统 crRNA 的成熟除了需要 Cas9 和 RNase 参与以外，还需要 tracrRNA 的指导 26。 CRISPR基因座在没有受到外界压力的情况下表达水平很低 34, 39。当外源的质粒或是噬菌体入侵宿主菌时 CRISPR的表达很快被诱导上调 35-36,38,40-41 。 5 CRISPR/Cas9 在基因治疗中的应用 与 ZFN 和 TALEN 这两种人工核酸酶相比， CRISPR/C
16、as9 有 一 个 极 大 的优 势。那就是 CRISRP/Cas9 可以改造成为切口酶，在 DNA 的特定位置制造单链切口，这样基本不会引起非同源末端连接 (NHEJ)，但可以激活细胞的同源重组 (HR)机制。实验证明，同一种细胞同一位点的单链切口和双链切口诱发的同源重组效率基本相同 47， 但是发生 NHEJ 的概率大为不同。因此，利用 Cas9作为切口酶可以高效地介导基因定点敲入或是对基因组的点突变，大大降低了NHEJ 风险和脱靶事件导致的基因组其他位置产生未知的突变。 Ding等 56在 Cell Stem Cell 上的论文报道 ， 在人 iPS 细胞中，在细胞相同、载体结构相似和位
17、点相同的情况下， CRISPR/Cas9 的定点突变效率至少是 TALEN的 2倍以上，并且诱发双等位基因的效率更高。人的 iPS 细胞在治疗一些人类的遗传疾病方面很有前景 57-60。例如用 iPS细胞治疗人类的镰刀型贫血症，可以将病人的皮肤细胞诱导成 iPS 细胞，然后利用 CRISPR/Cas9 突变型的切口酶来介导同源重组修复突变的血红蛋白基因，再将修复的 iPS 细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内。这种方法既能提高同源重组效率，又能避免使用 ZNF、 TALEN 和 CRISPR/Cas9时的脱靶效应造成的潜在危险。 CRISPR/Cas9与人 iPS 细胞的结合应用必然会对
18、人类遗传性疾病的治疗产生巨大的影响。 参考文献 ： 1. Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene,responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol, 1987, 169(12): 5429-5433 2. Jansen R, van Embden J D, Gaastra W,
19、et al. Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes. Omics: a Journal of Integrative Biology,2002, 6(1): 23-33 3. Mojica F J, Ferrer C, Juez G, et al. Long stretches of short tandem repeats arepresent in the largest replicons of the archaea Haloferax mediterranei and 4. Hal
20、oferax volcanii and could be involved in replicon partitioning. Mol Microbiol,1995, 17(1): 85-93 5. Jansen R, Embden J D, Gaastra W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol,2002, 43(6):1565-1575 6. Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, et al. Clu
21、stered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology, 2005, 151 (Pt 8):2551-2561 7. Mojica F J, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J, et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elem
22、ents. J Mol Evol, 2005, 60(2): 174-182 8. Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies.Microbiology, 2005, 151(Pt 3): 653-663 9. Makarova K S, Grishin NV,S
23、habalina SA,etal.A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes:computational analysis of the predicted enzymatic machinery,functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol Direct, 2006, 1: 7 10. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR pr
24、ovides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, 2007,315(5819): 1709-1712 11. Marraffini L A, Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.Science, 2008, 322(5909): 1843-1845 12. Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. CRISPRFinde
25、r: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats.Nucl Acids Res, 2007, 35(Web Server issue): W52-57 13. Rousseau C, Gonnet M, Le Romancer M, et al. CRISPI: a CRISPR interactive database. Bioinformatics, 2009, 25(24): 3317-3318 14. Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. T
26、he CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics, 2007, 8: 172 15. Godde J S, Bickerton A. The repetitive DNA elements called CRISPRs and their associated genes: evidence of horizontal transfer among prokaryotes. J Mol Evol, 20
27、06, 62(6):718-729 16. Deveau H, Garneau JE, Moineau S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annu Rev Microbiol, 2010,64: 475-493 17. Kunin V, Sorek R, Hugenholtz P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats. Genome Biol, 2007, 8(4): R6
28、1 18. Makarova K S, Aravind L, Grishin N V, et al. A DNA repair system specific for thermophilic Archaea and bacteria predicted by genomic context analysis.Nucleic Acids Res, 2002, 30(2):482-496 19. Heidelberg J F, Nelson W C, Schoenfeld T, et al. Germ warfare in a microbial mat community: CRISPRs p
29、rovide insights into the co-evolution of host and viral genomes. PloS One, 2009, 4 (1):e4169 20. Horvath P, Coute-Monvoisin A C, Romero D A, et al. Comparative analysis of CRISPR loci in lactic acid bacteria genomes. Int J Food Microbiol, 2009, 131(1):62-70 21. Haft D H, Selengut J, Mongodin E F, et
30、 al. A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes.PLOS Comput Biol, 2005, 1(6): e60 22. Sinkunas T, Gasiunas G, Fremaux C, et al. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system.
31、EMBO J, 2011, 30(7): 1335-1342 23. Haurwitz R E, Jinek M, Wiedenheft B, et al. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.Science, 2010, 329(5997):1355-1358 24. Wiedenheft B, Zhou K, Jinek M, et al. Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated i
32、n CRISPR-mediated genome defense. Structure, 2009, 17(6): 904-912 25. Wiedenheft B, van Duijn E, Bultema J B, et al. RNA-guided complex from a bacterial immune system enhances target recognition through seed sequence interactions. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(25): 10092-10097 26. Garneau J E, D
33、upuis M E, Villion M, et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.Nature, 2010, 468(7320): 67-71 27. Deltcheva E, Chylinski K, Sharma C M, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase .Nature, 2011, 471(7340):602-607 28. Ananth
34、araman V, Iyer L M, Aravind L. Presence of a classical RRM-fold palm domain in Thg1-type 3- 5nucleic acid polymerases and the origin of the GGDEF and CRISPR polymerase domains. Biol Direct, 2010, 5: 43 29. Hale C R, Zhao P, Olson S, et al. RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex.
35、 Cell, 2009, 139(5): 945-956 30. Terns M P, Terns R M. CRISPR-based adaptive immune systems.Curr Opin Microbiol, 2011, 14(3): 321-327 31. Portillo M C, Gonzalez J M. CRISPR elements in the Thermococcales: evidence for associated horizontal gene transfer in Pyrococcus furiosus. J Appl Genet, 2009,50(
36、4):421-430 32. Mojica F J, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J, et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiol,2009, 155(Pt 3): 733-740 33. Beloglazova N, Brown G, Zimmerman M D, et al. A novel family of sequence-specific endoribonucleases ass
37、ociated with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats. J Biol Chem, 2008, 283(29): 20361-20371 34. Brouns S J, Jore M M, Lundgren M, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science, 2008, 321(5891):960-964 35. Pougach K, Semenova E, Bogdanova E, et al. T
38、ranscription, processing and function of CRISPR cassettes in Escherichia coli.Mol Microbiol, 2010, 77(6):1367-1379 36. Pul U, Wurm R, Arslan Z, et al. Identification and characterization of E. coli CRISPR-cas promoters and their silencing by H-NS. Mol Microbiol, 2010, 75(6): 1495-1512 37. Agari Y, S
39、akamoto K, Tamakoshi M, et al. Transcription profile of Thermus thermophilus CRISPR systems after phage infection. J Mol Biol, 2010, 395(2):270-281 38. Hale C, Kleppe K, Terns R M, et al. Prokaryotic silencing (psi)RNAs in Pyrococcus furiosus. Rna, 2008, 14(12): 2572-2579 39. Lillestol R K, Shah S A
40、, Brugger K, et al. CRISPR families of the crenarchaeal genus Sulfolobus: bidirectional transcription and dynamic properties. Molecular Microbiology, 2009, 72(1): 259-272 40. Phok K, Moisan A, Rinaldi D, et al. Identification of CRISPR and riboswitch related RNAs among novel noncoding RNAs of the eu
41、ryarchaeon Pyrococcus abyssi. BMC Genomics, 2011, 12: 312 41. Lillestol R K, Redder P, Garrett R A, et al. A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea, 2006, 2(1): 59-72 42. Shinkai A, Kira S, Nakagawa N, et al. Transcription activation mediated by a cyclic AMP receptor protein fro
42、m Thermus thermophilus HB8. J Bacteriol, 2007, 189(10):3891-3901 43. Deveau H, Barrangou R, Garneau J E, et al. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. J Bacteriol, 2008, 190(4): 1390-1400 Semenova E, Nagornykh M, Pyatnitskiy M, et al. Analysis of CRISPR system fun
43、ction in plant pathogen Xanthomonas oryzae. FEMS Microbiology Letters,2009, 296(1): 110-116 44. Marraffini L A, Sontheimer E J. Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity. Nature, 2010, 463(7280):568-571 45. Barrangou R, Horvath P. CRISPR: new horizons in phage resistanc
44、e and strain identification. Annu Rev Food Sci Technol, 2012,3: 143-162 46. Hwang W Y, Fu Y, Reyon D, et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol, 2013, 31(3): 57 Mali P, Yang L, Esvelt K M, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013
45、,339(6121): 823-826 47. Cong L, Ran F A, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013, 339(6121): 819-823 48. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012, 337(6096): 816-82
46、1 49. Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci USA, 2012,109(39): E2579-2586 50. Lillestol R K, Redder P, Garrett R A, et al. A putative viral defence mechanism in archaeal cel
47、ls. Archaea, 2006, 2(1): 59-72 51. Shinkai A, Kira S, Nakagawa N, et al. Transcription activation mediated by a cyclic AMP receptor protein from Thermus thermophilus HB8. J Bacteriol, 2007, 189(10):3891-3901 52. Deveau H, Barrangou R, Garneau J E, et al. Phage response to CRISPR-encoded resistance i
48、n Streptococcus thermophilus. J Bacteriol, 2008, 190(4): 1390-1400 53. Semenova E, Nagornykh M, Pyatnitskiy M, et al. Analysis of CRISPR system function in plant pathogen Xanthomonas oryzae.FEMS Microbiology Letters, 2009, 296(1): 110-116 54. Marraffini L A, Sontheimer E J. Self versus non-self disc
49、rimination during CRISPR RNA-directed immunity. Nature, 2010, 463(7280):568-571 55. Barrangou R, Horvath P. CRISPR: new horizons in phage resistance and strain identification. Annu Rev Food Sci Technol, 2012,3: 143-162 56. Hwang W Y, Fu Y, Reyon D, et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol, 2013, 31(3): 57. Mali P, Yang L, Esvelt K M, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013, 339(6121): 823-826 58. Cong L,
