1、现代微生物学实验技术现代微生物学实验技术现代微生物学实验技术现代微生物学实验技术马玉超马玉超北京林业大学生物科学与技术学院北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼办公地点：生物楼117 117；电话：；电话：6233601662336016；Email:实实 验验 内内 容容实实 验验 内内 容容16S rRNA基因的 PCR扩增、电泳及系统发育分析染色 移法克隆 知序 的侧 序 体步 移法克隆 已 知序 列 的侧 翼 序 列 大肠杆菌 半乳糖苷酶的诱导表达- 利用 SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取16S rRNA基因的 PCR扩增、电泳及系统发育分
2、析窦桂明实 验 目 的实 验 目 的1 掌握 PCR的原理 增强对 PCR重要性的认识. 的原理 ， 增强对 重要性的认识 ；2 掌握 电泳技术及 系统发育分析的方法 为将来课题.掌握 电泳技术及 系统发育分析的方法 ， 为将来课题研究奠定基础。PCR技术的反应原理PCR（ Polymerase Chain Reaction）法 ，又称为 聚合酶链反应或 PCR扩增技术 是 一 种高效快速的体外 DNA聚合程序（ ）法 ，又称为 聚合酶链反应或 扩增技术 是 一 种高效快速的体外 聚合程序反应或 扩增技术 ， 是 种高效快速的体外 聚合程序反应或 扩增技术 ， 是 种高效快速的体外 聚合程序设
3、想 实现 改进与完善7294 55循循PCR循 环循 环PCR技术的反应原理5待扩增 DNA区域待扩增 区域DNA或 RNA模板或 模板594 5 min变性变性15555退火退火DNA引物引物聚合酶聚合酶555DNA聚合酶聚合酶dNTPs5聚合聚合5570Mg2+（缓冲液）（缓冲液）255循环 25 30次循环 次循环 - 次循环 次5目的基因目的基因30个循环： 2305 变性变性 加热 加热5 目标 DNA片段达目标 片段达25 引物引物退火退火2106-1075 5 底物底物延伸延伸变性退火延伸底物底物延伸延伸5 5 45 加热加热变性变性5 退火 引物退火 引物5 5 5退火 引物退
4、火 引物5 5 55 5 5 55 5 一个标准的 PCR过程核酸的凝胶电泳基本原理当 一 种分子被放置在电场中时 ， 它们就会以 一 定的速度移向适当 种分子被放置在电场中时 ， 它们就会以 定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度 电泳的迁移率这种电泳分子在电场作用下的迁移速度 电泳的迁移率 。迁移率的影响因素：电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分子与支持介质的摩擦系数等子与支持介质的摩擦系数等 。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的叫做多聚阴离子。方向：负 正种类：水平 垂直琼脂糖 聚丙烯酰胺普通 DNA小分子量RNA核酸二 、 琼脂糖凝胶电
5、泳二 、 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖：线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。加热凝固 网孔状的电泳介质 密度由琼脂糖的浓度决定： ， 。琼脂糖凝胶分辨 DNA片段的能力凝胶浓度 线形 DNA的最佳分辨范围（ bp）0.5% 1,000 30,0000.7% 800 12,0001.0% 500 10,000琼脂糖1.2% 400 7,0001.5% 200 3,00020% 50 2 0002.0% 50 ,琼脂糖凝胶分辨 DNA片段的范围 : 0.2-50kbDNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：核酸物理分子量的大小电压分子状态缓冲液
6、温度电泳指示剂：溴芬兰，距边缘 1cm左右停止电泳。电泳染色剂 ： 溴化乙锭 (ethidium bromide,简称 EtBr)， 扁平染料 ，电泳染色剂 ： 溴化乙锭 bromide,简称 ， 扁平染料 ，嵌到 DNA或 RNA分子的碱基之间，借助紫外灯观察。DNA Marker1.2kb800bp操 作 步 骤操 作 步 骤成 分 贮液浓度 使用量 (20 l体系 )成 分 水 14l10 GC Buffer Mg2+ Plus 2ldNTPs 2.5mmol 0.5l16Sp1 10pmol/l 1 l16S p2 10pmol/l 1l基因组 DNA 100g/ml 1lTaq酶 5
7、U/l 0.5l操 作 步 骤操 作 步 骤循环次数 反应条件1 95 （ 10min）30 94 ； 30s58 ； 1min72 ； 1min30s1 72 ； 10min1 72 (10min)琼脂糖凝胶电泳：(1) 称取琼脂糖，用适当的电泳缓冲液 (常用 1 TAE)配成所需浓度的胶 ； 10 TAE 缓冲液配制 ： 04MTris 乙酸 ； 0 02M浓度的胶 ； 缓冲液配制 ： 0.4M -乙酸 ； . EDTA， pH8.0(2) 置微波炉中加热煮沸 直至琼脂糖完全溶解 ； 置微波炉中加热煮沸 ， 直至琼脂糖完全溶解 ；(3) 按照每 20ml胶加入 1l Goldview/20
8、ml；(4) 凝胶溶液冷却至 50 左右 ， 倒入电泳胶盘 ， 避免出现气泡 ， 左右 ， 倒入电泳胶盘 ， 避免出现气泡 ，室温放置，至胶凝固；(5) 小心拔出梳子 ， 将胶盘放到有 1 TAE 缓冲液的水平电泳槽() ，中；(6) 酶切样品中加入 1/5 体积的 6 loading buffer，混匀，用移液器小心加到点样孔中，以稳定电压 (4-5V/cm) 电泳； 6加样指示剂配方 :0.25% 溴酚蓝 ;40%(W/V) 蔗糖水溶液；(7) 取出凝胶，紫外灯下观察电泳结果，如有必要，拍照记录。16S rRNA的系统发育分析1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACG
9、CT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAGC61 GGTAAGGCTC CTTCGGGAGT ACACGAGCGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GAGTAATCTG121 CCCTCCACTT TGGGATAAGC CTCGGAAACG AGGTCTAATA CCGAATACGA CCACTTCCTG181 CATGGGATGG TGGTGGAAAG TTTTTTCGGT GGGGGATGTG CTCGCGGCCT ATCAGCTTGT241 TGGTGGGGTA ATGGCCTACC AAGGCTTCGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG
10、GTGACCGGCC301 ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGGAC361 AATGGGCGGA AGCCTGATCC AGCAACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA421 CC C CAG CGGGGACGAA GCGCAAG GA CGG ACCCGC AGAAGAAGCA CCGGCCAAC T TTTCAG TGA CGGT T481 ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGC
11、GTA541 AAGGGCTCGT AGGCGGTTTG TCGCGTCGGG AGTGAAAACA CCGGGCTTAA CTCGGTGCTT601 GCTTTCGATA CGGGCAGACT AGAGGTATTC AGGGGAGAAC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT661 GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGTTCTCTGG GAATATCCTG 721 ACGCTGAGGA GCGAAAGTGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACACCG781 TAAACGTTGG GCGCT
12、AGGTG TGGGATCCAT TCCACGGGTT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT841 TAAGCGCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC901 CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GCGGATTAAT TCGATGCAAC GCGAAGAACC TTACCTGGGT GCGGATTAA TCGATGCAAC GCGAAGAAC TTACCTGGGT961 TTGACATACA CCGGAAAGCT GCAGAGATGT AGCCCCTTTT AGTCGGTGTA CAGGTGGTGC10
13、21 ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC1081 TCGTCCTATG TTGCCAGCAA GCCTTCGGGT GTTGGGGACT CATAGGAGAC TGCCGGGGTC1141 AACTCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAG TCATCATGCC CCTTATGTCC AGGGCTTCAC 1201 GCATGCTACA ATGGCCGGTA CAAAGGGCTG CGATCCCGTG AGGGGGAGCG AATCCCAAAA1261 AGCCGGTCTC AGTTC
14、GGATT GGGGTCTGCA ACTCGACCCC ATGAAGTCGG AGTCGCTAGT1321 AATCGCAGAT CAGCAACGCT GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC1381 ACGTCACGAA AGTCGGCAAC ACCCGAAGCC GGTGGCCTAA CCCTTGTGGA GGGAGCCGTC ACCCGAAGCC 1441 GAAGGTGGGG CTGGCGTTTG GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTA16S rRNA的系统发育分析NCBI Blast： http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/http:/www.bacterio.cict.fr/index.htmlMEGA 软件构建系统发育树
