乳酸环丙沙星对鲤鱼肠道菌群的影响.pdf

1、乳酸环丙沙星对鲤鱼肠道菌群的影响 杨雨辉 1 佟恒敏 1 卢彤岩 2 赵吉伟 2 李晓霞 1 王君 1 （ 1东北农业大学 150030 2中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 150076） 本文采用常规细菌的鉴定方法，研究了乳酸环丙沙星对鲤鱼肠道菌群的影响，结果表明鲤鱼经口灌服乳酸环丙沙星前后，细菌的数量和组成比例都发生了明显 的改变。鲤鱼在应用乳酸环丙沙星前，肠道前、中、后肠段的细菌数量为 106-108CFU/g，经口灌服乳酸环丙沙星后肠道细菌的数量减少，并且组成比例也发生了改变，用药后 120h 细菌的组成比例尚未完全恢复到用药前的水平，肠道内细菌的变化情况主要为，肠道前、中、后肠段的

2、气单胞菌属的比例都明显下降，其它的细菌比例明显升高，而且出现有些种属的细菌在用药后不能检出的现象。这些结果表明乳酸环丙沙星应用于水产养殖后，容易导致水产动物肠道菌群的失衡，且恢复到用药前的水平较慢。 关键词： 乳酸环丙沙星 肠道菌群 鲤鱼 研究 表明，在正常情况下鱼类肠道内存在着大量的细菌群落 1，这些细菌群落是动物长期进化的结果 2，它们和动物的免疫功能、营养需求都有着及其密切的关系 3,4。在水产养殖中，由于鱼病的发生而造成许多重大的经济损失，为了减少这种损失，各种抗菌药物被大量的使用，但是如果这些药物不被科学合理的应用，往往就会造成被应用动物的肠道菌群失衡，而引起新的疾病。由于抗菌药物的

3、不合理应用造成肠道疾病的病例在人医和兽医上已有不少文献的报道 5,6。 乳酸环丙沙星是第三代喹诺酮类药物，目前已被广泛应用于人医和兽医临床，并 且也被应用于水产养殖作为治疗鱼类细菌性感染的药物，但是有关该药对鱼类肠道菌群的影响在国内外还未见报道。本研究以鲤鱼为模型动物，检验了鲤鱼经口灌服乳酸环丙沙星后肠道内好氧及兼性厌氧菌群的种群和数量的变化，旨在为评价该种药物应用于水产动物后对肠道菌群的影响，同时为评价该药应用于水产养殖是否科学提供理论参考。 1 材料与方法 1.1 乳酸环丙沙星原粉 含量 98.5%，批号 010914，浙江新昌县康乐兽药有限公司生产。 1.2 实验鱼及饲养管理 本实验所用

4、的鲤鱼鱼种由黑龙江水产研究所良种试验场提供，选择体质健壮 ，体重 15020g 的鲤鱼，在室内暂养一周，每天按鱼体重的 2%投喂饲料，水温保持在 18-22，试验期间不投喂饲料。 1.3 药物投喂及试样的采集 将乳酸环丙沙星用双重纯化水溶解成 7.5mg/ml 的水溶液，用塑料软管强制灌入鲤鱼的食道，剂量为 10mg/kg.b.w，然后分别在灌服乳酸环丙沙星药液后 4、 8、 12、 24、 48、 72、96 和 120h 后取样。鲤鱼体表用 75%的酒精棉球消毒，打开腹腔，用棉线分别结扎食道、肛门和各段肠的交界处，再用剪刀分离各肠段，无菌水冲洗数遍后，剪碎，称取大约 0.2g 组织，加入

5、50 倍的灭菌生理盐水，匀浆，制成原液，每个时间点采取 5 尾鱼。 4 试剂及培养基的制作 1.4.1 分离培养基的制作 通讯作者 采用吉水等（ 1976）介绍的淡水鱼类琼脂培养基（ FWA），略做修改，准确称取硫酸镁0.05g、牛肉粉 2.50g，磷酸氢二钾 0.20g，葡萄糖 1.00g，蛋白胨 5.00g，氯化钠 5.00g，酵母粉 2.50g，琼脂粉 17g，加水 1000ml，用氢氧化钠调整 pH 至 7.2-7.4， 121，高压灭菌 20min后备用。 1.4.2 鉴别用试剂和培养基的制作 革兰氏染液的配置、氧化酶试纸的制作、葡萄糖发酵 产气培养基、运动性试验培养基、肌醇利用培养

6、基、需钠试验用培养基的制作 7， 8。 1.5 细菌计数 将各段肠原液做 10 倍系列稀释，在 FWA 培养基平板上涂布，于 30下培养 24-48h 后计数，并换算成每克肠所含的细菌数量。 1.6 细菌的鉴定 在每个时间点的 5 尾鱼中随机选择三尾鱼的肠道菌进行细菌鉴定，在各肠段细菌的分离板中，选择菌落清晰、分散而且菌落数在 30-300 之间的平板，随机地挑取 30 个菌落，用FWA 培养基进行纯培养后，置 4冰箱中保存，供细菌鉴定之用。菌种的鉴定参照一般细菌常用鉴定方法 7和周文豪 9的方法进行 ,对于个别本方法不能鉴定的细菌则不列入本研究的讨论范围。 2 结果 2.1 鲤鱼经口灌服乳酸

7、环丙沙星前后肠道细菌数量的变化及恢复 灌服乳酸环丙沙星前后，鲤鱼肠道细菌数量（用每克组织细菌数量的对数值 lgCFU/g表示）的变化如表 1 所示。未灌服乳酸环丙沙星的对照组的前、中、后肠段的细菌数量的对数值分别为 6.2010.165、 7.1340.329 和 8.4370.227。灌服乳酸环丙沙星后，前、中、后肠的细菌数量都呈减少的趋势，中肠、后肠的前 24h 各时间点的细菌数量和对照组的中、后肠细菌数量都存在着显著的差异（ P0.05），在用药后 24-48h 后细菌数量恢复到未用药前的水平，但前肠各时间点的细菌数量和对照组的细菌数量之间没有显著差异（ P0.05），即乳酸环丙沙星对鲤

8、鱼的前肠细菌数量没有很大的影响。 表 1：鲤鱼灌服乳酸环丙沙星前后肠道细菌数量（ lgCFU/g） Table1:the number of microflora in intestine after oral administration ciprofloxacin（ lgCFU/g） 肠 段 0h 4h 8h 12h 24h 48h 72h 96h 120h 前肠foregut 6.201 0.165 5.795 0.298 5.701 0.606 5.733 0.899 5.693 0.697 6.212 0.157 6.281 0.242 6.058 0.184 6.145 0.132

9、 中肠midgut 7.134 0.329 6.198 0.879 6.098 0.464 6.213 0.182 5.902 1.392 6.804 0.480 7.045 0.165 7.143 0.324 7.129 0.326 后肠hindgut 8.437 0.227 6.581 0.395 7.381 0.235 7.910 0.130 7.970 0.170 8.118 0.162 8.376 0.302 8.376 0.370 8.367 0.324 2.2 鲤鱼灌服乳酸环丙沙星前后肠道细菌组成的变化及恢复 鲤鱼灌服乳酸环丙沙星前后的肠道细菌的组成见表 2。由表 2 可以看出，

10、未灌服乳酸环丙沙星前，鲤鱼前肠的优势菌群为气单胞菌属 Aer.、不动杆菌属 Aci.、肠杆菌科 Ent.，灌服乳酸环丙沙星后优势菌群为气单胞菌属 Aer.、不动杆菌属 Aci.、肠杆菌科 Ent.、黄杆菌属Fla.，并且细菌的组成比例也发生了变化，其中气单胞菌属的组成比例下降，肠杆菌科和黄杆菌属的比例升高，不动杆菌属的比例基本不变。产碱菌属 Alc.在 12-48h 没有被检测到，而在其它时间点没有被检测到的弧菌属 Vib. 在 12-48h 却可以被检测到 。 未灌服乳酸环丙沙星前，鲤鱼中肠的优势菌群为气单胞菌属 Aer.、产碱菌属 Alc.、不动杆菌属 Aci.、肠杆菌科 Ent.，灌服乳

11、酸环丙沙星后优势菌群变为气单胞菌属 Aer.和肠杆菌科Ent.。中肠用药后，各个菌群的变化 趋势如下：气单胞菌的比例降低，肠杆菌科的比例升高。其他菌群的组成也发生了变化，其中不动杆菌属 Aci.和黄杆菌属 Fla.的比例是先升高后降低，用药 72h 后比例恢复到用药前的水平，产碱菌属 Alc.的比例在用药后的前些小时持续下降，在 8-12h 时已经不能被检出，在用药后 48h 基本上比例恢复到用药前的水平 。 表 2：鲤鱼灌服乳酸环丙沙星前后，肠道细菌组成 (%) Table2:the consisting ratio of microflora in intestine after oral

12、 administration ciprofloxacin(%) 肠段 菌群 对照 4h 8h 12h 24h 48h 72h 96h 120h Aer. 56.714.5 24.410.2 33.33.4 62.213.5 57.85.1 56.78.8 57.815.7 58.910.7 54.413.9 Ent. 8.91.9 17.85.1 16.78.8 15.56.9 11.17.7 7.85.1 10.03.3 6.73.4 6.76.7 Fla. 6.73.4 25.56.9 26.710 8.97.0 4.42.0 5.53.9 6.73.4 4.42.0 4.42.0 Ac

13、i. 13.33.4 15.62.0 16.76.7 14.45.1 13.36.7 13.38.8 12.25.1 15.62.0 15.75.1 Alc. 2.21.9 4.42.0 3.30.0 3.30.0 4.42.0 3.12.3 Mor. 6.73.4 5.65.1 7.81.9 5.62.0 8.91.9 7.85.1 6.73.4 3.33.4 6.73.4 Vib. 5.62.0 4.42.0 2.21.9 Aer. 61.111.7 25.53.7 42.211.7 77.89.6 57.818.3 58.910.2 58.98.4 58.916.5 63.417.7 E

14、nt. 6.73.4 4.42.0 24.48.4 20.05.8 24.48.4 22.28.4 11.15.1 7.81.9 5.62.0 Fla. 4.42.0 30.06.7 22.28.4 7.81.9 4.42.0 6.73.4 3.30.0 Aci. 7.85.1 103.3 5.62.0 1.11.9 2.21.9 7.81.9 5.62.0 5.65.1 Alc. 8.91.9 2.21.9 5.62.0 7.81.9 7.81.9 8.91.9 7.81.9 Mor. 5.72.0 14.42.0 - 6.73.4 6.75.8 6.73.4 6.65.8 Vib. 2.2

15、1.9 5.62.0 1.11.9 3.30.0 4.42.0 6.73.4 1.11.9 2.21.9 3.3 Ple. 4.42.0 6.73.4 7.83.9 6.73.4 6.73.4 4.43.4 Aer. 55.610.2 23.33.4 52.210.2 58.98.4 48.913.4 51.110.7 51.18.4 56.611.5 55.610.2 Ent. 7.83.9 26.716.7 27.813.5 18.97.0 18.95.1 13.33.4 14.45.1 4.42.0 6.73.4 Fla. 3.33.4 16.73.4 16.76.7 12.21.9 2

16、.21.9 3.33.4 3.33.4 3.35.8 4.42.0 Aci. 8.97.0 14.42.0 Alc. 6.73.4 2.21.9 4.45.1 3.33.4 4.42.0 3.30.0 2.21.9 4.42.0 Mor. 6.73.4 4.42.0 3.33.4 4.42.0 6.73.4 4.42.0 Ple. 11.11.9 7.81.9 5.72.0 2.21.9 Vib 2.21.9 4.42.0 2.21.9 说明（ note）： ，未检测到 not detected； Aer. 气单胞菌属（ Aeromonas） ; Ent.肠杆菌科（ Enterobacteri

17、aceae） ; Fla.黄杆菌属（ Flavobacterium） ; Aci.不动杆菌属（ Acinetobacter） ; Alc. 产碱菌属（ Alcaligence） ; Mor.莫氏菌属（ Moraxella） ; Ple.（邻单胞菌属） Plesiomonas; Vib.（弧菌属） Vibrio; 未灌服乳酸环丙沙星前，鲤鱼后肠的优势菌群为气单胞菌属 Aer.、邻单胞菌 Ple.、不动杆菌属 Aci.、肠杆菌科 Ent.，灌服乳酸环丙沙星后优势菌群变为气单胞菌属 Aer.和肠杆菌科Ent.、黄杆菌属 Fla.。各个菌群的组成比例也发生了改变，其中，气单胞菌的比例降低，而肠杆菌科、

18、黄杆菌属的比例升高。不动杆菌在用药 12h-120h 一直都不能被检测到，其它几个细菌属的组成也都发生了改变。 3 讨论 本研究的结果表明，在用药前鲤鱼前、中、后肠段的细菌数量为 106-108CFU/g。周文豪等（ 1997） 9报道草鱼的前、中、后肠段的细菌密度为 105-107CFU/g，吉水 等（ 1976） 10报道了鲑科鱼类的肠道细菌，发现其密度为 104-107CFU/g， Sugita 等（ 1983） 11检测了 Tama河 7 种淡水鱼类肠道细菌，发现其细菌密度为 105-108CFU/g，这些结果表明鱼类正常的肠道细菌的数量是在一定范围内随着种类和生活环境等因素的不同而存

19、在着一定的差异。同时，作者也观察到鲤鱼肠道菌群的数量具有从前肠至后肠逐渐增多的现象。这与陈永 12、袁春营用鲤鱼 13、周文豪用草鱼 9、 禹惠明等 14用断奶仔猪观察的结果是一致的，周文豪等人认为这可能是由于肠道内容物由 前向后推进的缘故，但作者在试验过程中发现鲤鱼肠道细菌的种类组成前中后并没有明显的差异，这与周文豪等观察到草鱼前肠菌群较中、后肠的类群多的结果不一致，这可能和鱼的品种有关，也可能是由于其它原因造成的，但正是由此，作者认为肠道不同部位菌数变化可能不是肠道内容物由前向后推进的唯一原因，还可能存在着其它机制，因为在后肠，营养物质在后肠被充分的消化和分解，其结果可能是肠道内容物及其环

20、境更有利于微生物的生长繁殖，但这一机制尚需进一步研究。 鲤鱼灌服乳酸环丙沙星后肠道细菌的数量减少，并且组成比例也发生了改变，这些显然是由于乳酸环丙沙星的对肠道细菌产生影响造成的。在本研究中，各个肠段的细菌的组成比例发生了明显的改变，其中，前、中、后肠段的气单胞菌属的组成比例都明显下降，其它的细菌比例明显升高，而且出现有些种属的细菌在用药后不能检出的现象。这一结果表明，多数肠道细菌对乳酸环丙沙星敏感，但敏感性不同，用药后可造成动物肠道菌群失衡。灌服抗菌药物后对水生动物肠道菌群的影响，已有一些文献报道，其中，周文豪等报道了灌服氯霉素和土霉素对草鱼肠道菌群的影响，发现土霉素对草鱼肠道菌群的数量及组成

21、均有较大的影响，而氯霉素仅对其数量有降低作用 ，而对其组成无明显影响。陈孝煊等 15报道了呋喃唑酮对草鱼肠道菌群的影响，发现用药后草鱼肠道优势菌群发生了较为明显的变化，出现了比较多的弧菌，而假单胞菌和产碱杆菌属则未能检到。从这些结果可以可见，大多数抗菌药对鱼类的肠道菌群是有影响的，但不同的抗菌药物对肠道菌的影响程度不同，所以在应用抗菌药治疗鱼类细菌感染时应充分考虑抗菌药物对肠道菌群影响这一副作用，防止抗菌药物在渔业生产上的滥用。至于乳酸环丙沙星应用后，肠道菌群的这些变化对动物的免疫功能及营养需求是否会造成影响，还须进一步探讨，而且该药应用于水产养殖是 否科学也需进一步的研究。 参考文献 1.陈

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25、 ,刘毅辉等 .呋喃唑酮对草鱼肠道菌群的影响 .水利渔业 ,1999,19(3):3436. The effect of ciprofloxacin on microflora in intestine of carp Yangyuhui1 tonghengmin1 lutongyan2 zhaojiwei2 lixiaoxia 1 wangjun1 (1.North East Agricultural University， Harbin 150030, China 2.Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Acad

26、emy of FisherySciences) The general method of identifying bacteria was used in the paper for studying the effect of ciprofloxacin on microflora in intestine of carp. The bacteria number in foregut, midgut, hindgut is 106-108CFU/g before oral administration ciprofloxacin. The changing of the number a

27、nd consisting ratio of microflora was noticed after oral administration ciprofloxacin. The consisting ratio of bacteria wasnt recovery after 120h of oral administration ciprofloxacin. The radio of Aer. declined but that of the rest bacteria increased and some of bacteria couldnt be detected after oral administration with ciprofloxacin The result shows that the balance of microflora in intestine of carp was damaged seriously ,moreover, its recovery is slow. Keywords: ciprofloxacin microflora in intestine carp