1、国 内 信 息五 种 基 因 克 隆 技 术经 华 中 农 业 大 学 周 国 岭 先 生 对 国 内 外 64 篇 有 关 基 因 克 隆 技 术 的 论 文 概 括 和 分 析 ,当 前 基 因 克 隆 技 术 主要 有 5 个 类 别 ,即 体 位 克 隆 或 状 态 克 隆 、 转 位 或 转 DNA 标 记 法 、 同 系 位 候 选 基 因 法 、 快 捷 顺 序 标 记 法 、 差 接式 快 捷 基 因 克 隆 法 等 。1 体 位 克 隆 或 状 态 克 隆首 先 将 目 的 基 因 精 确 定 位 于 分 子 标 记 连 锁 图 上 ,用 连 锁 标 记 筛 选 大 片 段
2、YAC ,BAC , TAC ,PAC 或 Cos2mid 等 文 库 ,构 建 含 目 的 基 因 区 的 精 细 物 理 图 谱 ,采 用 染 色 体 操 作 法 逐 步 接 近 目 的 基 因 ,如 拟 南 芥 的 WIG2GUM 基 因 克 隆 ,人 的 NPC1 基 因 克 隆 。 若 侧 翼 标 记 与 目 的 基 因 连 锁 非 常 紧 密 ,就 可 获 得 包 含 目 的 基 因 的 大片 段 克 隆 。 将 此 作 亚 克 隆 分 析 或 作 探 针 筛 选 DNA 文 库 ,并 将 目 的 基 因 定 位 于 一 个 较 小 的 DNA 片 段 上 ,再作 序 列 分 析
3、与 功 能 鉴 定 ;若 从 DNA 文 库 中 取 BAC 或 PAC 克 隆 末 端 序 列 分 离 体 位 克 隆 ,利 用 BACP 或 PAC载 体 特 有 酶 切 位 点 Not I 或 sfi I 和 BAC 片 段 中 多 酶 切 位 点 EcoRV ,HpaI ,StuI ,XmnI 进 行 双 酶 切 再 与 质 粒体 连 接 ,并 用 PCR 来 分 离 ,则 对 BAC 长 链 末 端 序 列 的 分 析 和 鉴 定 就 更 快 速 而 高 效 。体 位 克 隆 或 状 态 克 隆 曾 用 于 分 离 与 拟 南 芥 种 子 形 成 和 发 芽 相 关 的 脱 落 酸
4、信 号 传 导 基 因 AB I3、 拟 南 芥 - 3 脂 肪 酸 脱 饱 和 酶 基 因 FAD3、 番 茄 抗 霜 霉 病 基 因 Pto、 水 稻 抗 白 叶 枯 病 基 因 XaZ1、 小 麦 抗 线 虫 基 因 Cre3以 及 200 多 个 与 人 遗 传 性 疾 病 相 关 基 因 的 克 隆 。这 一 类 别 的 克 隆 虽 然 作 用 很 大 ,但 由 于 需 要 构 建 基 因 组 文 库 ,建 立 饱 和 分 子 标 记 连 锁 图 ,要 完 善 遗 传 转化 体 系 ,还 要 作 大 量 测 序 工 作 ,故 此 法 投 资 较 大 ,应 用 也 有 一 定 的 局
5、限 性 。 但 随 着 比 较 基 因 组 学 的 发 展 ,可 利用 同 科 异 种 间 染 色 体 共 线 性 ,通 过 比 较 基 因 组 分 析 和 染 色 体 的 稳 定 性 ,可 将 物 种 性 状 基 因 或 分 子 标 记 直 接 定位 于 该 分 子 标 记 连 锁 图 中 。 如 将 小 麦 控 制 开 花 基 因 (Vrn)和 水 稻 控 制 谷 粒 硬 度 基 因 ( Ha) 定 位 于 第 5 组 染 色体 上 ;又 如 利 用 水 稻 图 谱 信 息 筛 选 水 稻 和 小 麦 同 线 区 的 BAC 或 YAC 测 序 和 搜 索 候 选 基 因 。 也 还 有
6、较 多 的将 Q TL 定 位 于 分 子 标 记 连 锁 图 上 ,借 鉴 体 位 或 状 态 克 隆 法 分 离 贡 献 率 大 的 Q TL 来 改 良 某 些 不 良 性 状 而 适合 现 代 农 业 的 要 求 。2 转 位 或 转 DNA 标 记 法此 法 有 五 大 基 本 程 序 ,即 首 先 进 行 突 变 体 的 诱 变 和 鉴 定 ;第 二 用 转 位 或 转 DNA 作 标 记 DNA 制 成 探 针或 引 物 筛 选 突 变 体 基 因 组 文 库 ;第 三 用 反 义 PCR 技 术 分 离 出 标 记 DNA 两 侧 的 目 的 基 因 部 分 序 列 ;第 四
7、依 据序 列 设 计 探 针 或 引 物 筛 选 野 生 型 基 因 组 文 库 ,并 分 离 出 完 整 的 基 因 ;第 五 用 基 因 互 补 测 验 手 段 检 测 此 法 的 功能 。利 用 此 法 可 克 隆 到 玉 米 抗 圆 斑 病 基 因 HML ,利 用 其 AC/ DS 系 统 克 隆 到 番 茄 抗 叶 霉 病 基 因 Cf - 9 ,利 用其 En/ Spm 系 统 克 隆 到 拟 南 芥 的 1 个 雄 性 不 育 基 因 ,利 用 其 Mutator 系 统 克 隆 到 玉 米 T - 胞 质 中 1 个 核 恢 复基 因 rf2 ,还 可 利 用 此 法 克 隆
8、 到 1 个 调 节 花 器 官 发 育 的 转 录 因 子 基 因 A G和 拟 南 芥 中 1 个 抗 线 虫 有 关 的 基因 。由 于 此 法 多 用 于 异 源 植 物 ,转 位 频 率 不 高 ,拷 贝 数 过 多 ,易 使 诱 变 频 率 很 低 ,难 以 获 得 转 位 突 变 体 ,而 亲本 所 含 转 位 或 通 过 转 基 因 或 杂 交 进 行 转 位 才 能 引 入 ,故 此 法 有 其 局 限 性 。 特 别 对 特 定 环 境 或 特 定 发 育 阶 段有 突 变 表 型 基 因 或 和 大 基 因 组 中 以 基 因 家 族 形 式 存 在 与 有 功 能 补
9、偿 的 部 分 基 因 家 族 。 在 转 位 过 程 中 虽 然 发生 插 入 突 变 ,但 不 易 看 到 突 变 表 型 。 这 也 使 转 位 或 转 DNA标 记 法 仅 限 于 分 离 克 隆 那 些 有 明 显 插 入 突 变 表生 物 技 术 通 报 国 内 信 息 B IO TECHNOL O G Y BULL ETIN 2002 年 第 6 期型 的 基 因 。 为 此 ,此 法 发 展 成 转 位 收 集 或 俘 获 的 无 表 型 突 变 基 因 ,包 括 增 强 子 俘 获 和 基 因 俘 获 两 种 。 当 前 由于 DNA 测 序 技 术 飞 快 发 展 ,大 量
10、 基 因 序 列 信 息 和 未 知 功 能 的 基 因 被 发 现 ,利 用 转 位 DNA 标 记 法 鉴 定 基 因生 物 功 能 的 技 术 更 加 广 泛 。3 同 系 位 候 选 基 因 法为 同 源 序 列 候 选 基 因 法 ,根 据 基 因 家 族 各 成 员 间 保 守 氨 基 酸 序 列 设 计 引 物 ,以 此 对 含 有 目 的 基 因 DNA文 库 用 PCR 扩 增 ,再 扩 增 、 克 隆 和 功 能 鉴 定 。 对 植 物 抗 病 基 因 所 具 有 保 守 氨 基 酸 序 列 (核 苷 酸 结 合 位 点NBS、 富 亮 氨 酸 重 复 序 列 L RR、
11、丝 氨 酸 苏 氨 酸 蛋 白 激 酶 ST K、 亮 氨 酸 拉 链 L Z 和 横 跨 膜 结 构 TM 等 ) ,设 计 引物 扩 增 植 物 DNA 文 库 ,并 从 所 获 得 的 抗 性 克 隆 中 找 到 一 些 新 的 抗 性 候 选 基 因 。 诸 如 根 据 谷 氨 酸 脱 氢 酶 基因 GDH 结 构 中 某 些 序 列 存 在 物 种 中 的 保 守 性 设 计 引 物 ,经 RT - PCR 扩 增 产 物 制 备 探 针 筛 选 龙 须 草 cDNA文 库 ,可 获 得 GDH 的 整 个 cDNA ;根 据 高 度 同 源 性 基 因 ,可 直 接 制 备 探 针
12、 作 杂 交 筛 选 出 另 一 物 种 DNA 文 库 ,再 用 豌 豆 淀 粉 合 成 酶 SS 的 cDNA 作 探 针 筛 选 小 麦 的 cDNA 文 库 ,可 获 得 小 麦 SS a 的 cDNA ;根 据 红 海 鲷和 红 鳟 鱼 的 生 长 激 素 GH 基 因 的 cDNA 筛 选 gsb 的 cDNA 文 库 ,获 得 gsb GH 的 cDNA 克 隆 ;还 根 据 gsb GH的 cDNA 筛 选 gsb 的 基 因 组 文 库 ,克 隆 出 gsb GH 基 因 。对 此 法 ,国 内 外 生 物 技 术 学 者 虽 然 广 泛 重 视 ,但 也 提 出 了 应 注
13、 意 的 问 题 : 由 于 密 码 子 的 简 并 性 和 不 同源 序 列 之 间 的 同 源 程 度 差 异 ,对 简 并 性 引 物 特 异 性 设 计 一 定 要 周 密 、 完 善 和 适 当 ; 由 于 某 些 同 源 序 列 并 不专 层 某 一 基 因 家 族 ,因 而 扩 增 产 物 就 不 一 定 是 某 一 基 因 家 族 的 成 员 ; 由 于 基 因 家 族 成 员 多 成 族 存 在 ,在 运用 此 法 所 克 隆 出 的 基 因 片 段 是 否 是 目 的 基 因 ,尚 需 深 入 判 断 和 鉴 定 。 为 此 ,PCR 扩 增 产 物 和 克 隆 出 来 的
14、 基因 ,需 作 基 因 及 其 性 状 分 离 分 析 和 遗 传 转 化 功 能 的 鉴 定 ,以 便 筛 选 到 目 的 基 因 ,以 区 别 同 源 区 域 的 基 因 还 是趋 异 区 域 的 基 因 。 如 原 癌 基 因 、 同 源 异 型 基 因 、 肌 球 蛋 白 基 因 等 。4 快 捷 顺 序 标 记 法 ( EST)在 人 类 基 因 组 和 其 他 生 物 组 计 划 及 计 算 机 的 运 用 过 程 中 , EST 是 完 整 基 因 上 能 特 异 性 标 记 基 因 的 一 部分 序 列 ,它 包 含 了 基 因 结 构 信 息 区 ,可 与 其 他 基 因
15、相 区 别 。 大 规 模 EST 克 隆 及 其 资 料 库 的 建 立 ,为 进 一 步 利用 生 物 信 息 学 克 隆 基 因 提 供 了 有 利 条 件 。 其 步 骤 有 六 : 对 已 知 部 分 序 列 作 数 据 库 分 析 ,筛 选 出 代 表 新 基 因的 EST 及 相 应 重 叠 群 与 定 位 信 息 ,并 设 计 引 物 和 制 备 探 针 ; 利 用 探 针 筛 选 cDNA 文 库 ,获 得 cDNA 阳 性 克隆 ,用 引 物 和 cDNA 载 体 臂 进 行 巢 式 PCR 和 5 、 3 2RACE ,获 得 5 端 和 3 端 部 分 400bp 序
16、列 ; 测 序 阳 性 克隆 和 末 端 序 列 ; 分 析 数 据 库 中 新 序 列 包 括 基 因 同 源 性 、 拼 接 延 伸 、 ORF 识 别 、 结 构 和 翻 译 蛋 白 质 等 ; 若 发现 有 新 EST 定 位 信 息 ,即 可 对 基 因 作 定 位 和 结 构 分 析 ,否 则 要 重 筛 选 基 因 文 库 ,作 测 序 和 FISH 定 位 ; 对发 现 出 的 新 基 因 应 作 突 变 检 测 和 表 达 分 析 。目 前 ,应 用 EST 法 快 捷 、 经 济 、 效 果 都 很 好 。 国 际 相 当 数 量 的 基 因 分 离 是 从 分 析 同 源
17、 EST 开 始 的 ,如 发现 和 克 隆 肿 瘤 基 因 、 克 隆 新 一 簇 哺 乳 动 物 DNA52胞 苷 甲 基 转 移 酶 基 因 。 分 析 克 隆 到 细 胞 分 裂 素 的 1 个 横 跨膜 受 体 基 因 GCR ,分 析 发 现 3 个 前 列 腺 特 异 表 达 基 因 ,可 用 于 前 列 腺 癌 的 基 因 治 疗 。5 差 接 式 快 捷 基 因 克 隆 法亦 为 差 异 表 达 基 因 分 离 法 ,其 表 达 基 因 的 3 种 方 法 为 差 式 筛 选 、 扣 除 杂 交 、 差 异 展 示 反 转 录 PCR (DDRT- PCR) 。 差 式 筛
18、选 分 别 从 有 特 异 表 达 基 因 的 目 标 样 ( TS) 和 无 特 异 表 达 基 因 的 参 照 样 ( RS) 中 提 取 mRNA、反 转 录 为 cDNA 构 建 TS 的 cDNA 文 库 ,又 分 别 将 TS 和 RS 中 的 mRNA 制 成 cDNA 探 针 ,用 TS 和 RS 的cDNA 探 针 与 Ts cDNA 文 库 的 菌 落 或 噬 菌 斑 作 原 位 杂 交 ,选 出 只 与 TS 杂 交 的 TS 特 异 表 达 的 克 隆 ;扣 除 杂交 是 用 TS 提 取 mRNA 反 转 录 成 cDNA 探 针 与 RS 过 量 的 mRNA 或
19、cDNA 杂 交 ,移 去 杂 交 分 子 和 过 量 的 RS的 mRNA 或 cDNA ,将 不 形 成 杂 交 体 的 TS 的 cDNA 纯 化 、 富 集 、 扩 增 ,建 立 差 异 表 达 基 因 cDNA 文 库 ,回 收cDNA ;DDRT - PCR 是 分 别 用 TS 和 RS 的 总 mRNA 作 模 板 ,用 12 个 锚 定 引 物 T11MN 错 定 mRNA 的polyA 末 端 ,借 助 逆 转 录 酶 合 成 cDNA 第 一 链 ,获 得 mRNA/ cDNA ,再 用 相 同 的 3 错 定 锚 定 引 物 和 5 端 随 机742002 年 第 6
20、期 生 物 技 术 通 报 Biotechnology Bulletin 引 物 分 别 扩 增 TS、 RS 的 mRNA/ cDNA ,其 扩 增 产 物 用 序 列 胶 电 泳 分 析 差 异 表 达 结 果 ,并 将 差 异 带 DNA 回收 、 分 析 、 鉴 定 ,以 获 得 最 终 差 异 表 达 基 因 。 秦 春 圃应 用 FISH评 估 IFN治 疗 CML 的 疗 效应 用 间 期 荧 光 原 位 杂 交 技 术 ( FISH) 评 估 干 扰 素 ( IFN) 治 疗 慢 性 粒 细 胞 白 血 病 (CML) 有 较 好 疗 效 。 主持 这 一 技 术 ( FISH
21、)的 山 东 济 宁 市 第 一 人 民 医 院 的 李 强 医 生 等 ,为 探 讨 FISH 检 测 CML IFN 治 疗 体 内 残 留Ph 阳 性 细 胞 的 效 果 ,采 取 间 期 FISH 的 方 法 ,对 7 例 未 治 疗 CML 病 者 和 17 例 IFN - - 2b 长 期 治 疗 CML病 者 进 行 治 疗 ,并 检 测 体 内 Ph 阳 性 细 胞 的 变 化 。 其 结 果 :正 常 对 照 组 假 阳 性 率 为 3. 87 % ( 0. 94 %) ,确 定正 常 值 小 于 6. 68 %( - 3s) 。 未 治 疗 组 Ph 阳 性 细 胞 平 均
22、 为 89. 21 % , IFN 治 疗 组 Ph 阳 性 细 胞 平 均 为 44.86 % ,与 未 治 疗 组 相 比 没 有 显 著 性 差 异 ( P 0. 05) 。 细 胞 遗 传 学 有 效 病 患 者 Ph 阳 性 细 胞 平 均 为 26. 30 % ,与未 治 疗 组 相 比 有 显 著 性 差 异 P 0. 05) ,且 Ph 阳 性 细 胞 的 减 少 与 IFN 的 用 药 总 剂 量 具 有 相 关 性 ( r = - 0.666 ,P = 0. 002) 。应 用 间 期 FISH 技 术 的 结 果 ,有 许 多 优 越 性 和 良 好 效 果 。 首 先
23、,所 用 bcr 探 针 全 长 近 300kb ,横 跨 m - bcr的 M - bcr ,使 典 型 CML 能 够 显 示 bcr 一 个 完 整 信 号 和 两 个 重 排 的 信 号 ;其 次 ,本 技 术 检 测 的 假 阳 性 率 为3. 87 % ,表 明 新 建 立 的 方 法 能 有 效 判 断 Ph 阳 性 细 胞 ,而 未 治 疗 组 存 在 Ph 阴 性 细 胞 ,主 要 与 杂 交 信 号 重 叠 、靶 细 胞 未 完 全 灭 活 和 探 针 杂 交 不 完 全 及 T 细 胞 未 受 克 隆 累 积 有 关 。 其 阴 性 率 出 现 10. 79 % ,表 明
24、 检 测 结 果精 确 可 靠 ;第 三 ,FISH 的 结 果 与 细 胞 遗 传 学 结 果 明 显 相 关 并 具 有 四 大 特 征 : 在 细 胞 遗 传 学 检 测 Ph 染 色 体尚 无 变 化 的 情 况 下 ,FISH 检 测 却 有 明 显 变 化 ; 在 中 ,前 者 显 示 Ph 染 色 体 转 阴 时 ,后 者 仍 然 发 现 其 Ph 细胞 克 隆 趋 势 在 减 少 。 这 表 明 后 者 不 受 细 胞 分 裂 周 期 影 响 而 更 精 确 判 断 IFN 治 疗 后 体 内 的 荷 瘤 量 ; 细 胞 遗传 学 检 测 可 能 反 映 不 同 病 患 者 体
25、 内 恶 性 克 隆 细 胞 增 殖 状 况 差 异 ,但 是 否 代 表 CML 自 身 异 质 性 , IFN 治 疗 的敏 感 性 、 预 后 的 相 关 性 ,这 与 FISH 完 全 缓 解 不 同 患 者 之 间 的 结 果 不 相 一 致 ,故 尚 待 深 入 作 对 比 研 究 ; IFN治 疗 有 效 的 病 患 者 ,其 用 量 与 其 Ph 阳 性 细 胞 的 残 留 量 呈 显 著 负 相 关 。 为 此 ,可 借 鉴 这 种 显 著 负 相 关 ,应 用于 早 期 判 断 IFN 的 敏 感 程 度 和 用 药 的 时 限 。总 之 ,间 期 FISH ,比 染 色
26、体 核 型 、 RT - PCR 技 术 更 能 准 确 评 价 IFN 治 疗 CML 对 体 内 的 负 荷 量 和 治 疗CML 的 真 实 疗 效 。 它 是 一 种 敏 感 、 定 量 、 精 确 判 断 CML 用 干 扰 素 治 疗 的 实 用 技 术 ,而 且 还 可 作 为 一 个 有 用的 指 标 判 断 病 患 者 对 干 扰 素 的 敏 感 性 。 为 此 ,应 用 间 期 荧 光 原 位 杂 交 技 术 评 估 干 扰 素 治 疗 慢 性 粒 细 胞 白 血病 患 者 的 疗 效 是 好 的 ,特 别 是 比 起 国 内 外 传 统 方 法 有 较 大 的 优 越 性
27、 和 临 床 实 用 价 值 。秦 春 圃猪 胚 发 育 分 子 调 控 机 理 与 基 因 转 殖 猪近 年 来 ,台 湾 大 学 畜 产 系 和 有 关 研 究 机 构 ,对 畜 禽 生 物 分 子 学 与 胚 胎 分 子 学 调 控 方 面 的 研 究 有 一 定 进展 ,在 猪 滤 泡 发 育 分 子 调 控 、 猪 胚 胎 发 育 分 子 调 控 和 基 因 转 殖 猪 的 研 究 都 取 得 了 重 大 成 果 。1 猪 滤 泡 发 育 分 子 调 控台 大 畜 产 系 在 动 物 生 殖 细 胞 早 期 发 育 和 在 育 种 遗 传 方 面 起 步 较 早 ,他 们 在 90
28、年 代 后 期 ,用 聚 合 酶 链 反应 技 术 ( PCR)成 功 地 研 究 了 我 国 梅 山 猪 、 桃 园 猪 、 小 耳 猪 和 国 外 兰 德 瑞 斯 、 约 克 夏 、 杜 洛 克 猪 等 的 激 滤 泡 素 接受 体 基 因 FSHR5 端 上 游 区 城 的 基 因 片 段 ,如 梅 山 猪 的 这 种 片 段 长 度 为 1112bp ,桃 园 猪 的 为 1042bp ,小 耳 猪的 为 1096bp ,兰 德 瑞 斯 的 为 1049bp ,约 克 夏 的 为 1043bp ,杜 洛 克 的 为 1055bp。 这 些 为 畜 禽 分 子 育 种 和 基 因转 殖 的 生 物 学 研 究 创 造 了 有 利 条 件 ,奠 定 了 基 础 。84 生 物 技 术 通 报 Biotechnology Bulletin 2002 年 第 6 期
