1、iQ5iQ5荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR仪仪仪仪操作手册操作手册操作手册操作手册2iQ5iQ5荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR仪监控软件操作程序仪监控软件操作程序仪监控软件操作程序仪监控软件操作程序接通光学检测部分的电源，实验前先让系统预热30分钟，打开iCycler扩增系统（即仪器的基座），打开电脑，（显示windowsXP或2000界面），双击iQ5的软件，启动。iQ5软件有5个模块，每个模块的图像始终显示在屏幕的左侧，激活的模块背景为橙色，未激活的模块背景为灰色，每个模块再细分有此模块下的功能视窗。11W orkshopW WW orkshop（工作模块）：用
2、于设计反应板、程序及运行实验，选择实验文件，打开以往反应数据（用于分析）。W orkshopW WW orkshop模块包括SetupSetup（设置）和PlatePlateSumarySumary（板设置概要）视窗。SetupSetup（设置）视窗下有4个窗口：ProtocolProtocol（程序）、PlatePlate（板）、RunRunSetSet（运行设置）和DataDataFileFile（资料文件），用于选择、打开、编辑或创建新文件。在SetupSetup（设置）视窗下，选择的ProtocolProtocol（程序）和PlatePlate（板）设置可以RunRun（运行），或者选
3、择的DataDataFileFile（资料文件）可以被打开在DataDataAnalysiAnalysi（资料分析）视窗中进行分析。22Run-TimeRun-TimeCentralCentral（运行-实时监测中心模块）：这个模块用于启动和监测实验运行。当ProtocolProtocol和PlatePlate设定好之后，点击RunRun（运行）或RunRunEdEdPointPoint（终点运行）。33DataDataAnalysisAnalysis（数据分析模块）：这个模块包含一系列工具，可以让你对实验数据进行多种分析。在这个模块中显示QuantiativeQuantiative（定量）、
4、MeltMeltCurve/PeakCurve/Peak（融解曲线/峰）、EndEndPointPoint（终点）、AleAleliclicDiscriminationDiscrimination（等位基因区分）和GenGenExpresionExpresion（基因表达）分析。板编辑界面允许实验运行结束后进行板的设置，允许更正不正确的样本设置。当你从W orkshopW WW orkshop打开一个已保存的数据文件，DataDataAnalysisAnalysis会自动打开。44CalibrationCalibration（校准模块）：为了从你的实时荧光PCR实验中获得最好的数据，iQ5在安
5、装时必须进行校准。在这个模块下，校准路径简单而易操作。校准程序包括：纯染料校准（当你增加一些新的染料时，可以进行这一操作程序）、MaskAlignment、背景和孔因子校准。55用户文件，用户设置实验默认参数。311W orkshopW WW orkshop窗口下有SetupSetup和PlatePlateSumarySumary22个子窗口激活SetupSetup，有4个子窗口ProtocolProtocol，PlatePlate，RunRunStartStart，DataDataFileFile，绿色框为激活窗口1）激活ProtocolProtocol，此窗口出现绿色框，点击Edit（编辑
6、）或CreatNew（创建新程序）。点击Edit：编辑程序视窗中选择的程序，如2Step.tmo，弹出程序编辑界面，设置PCR热循环的程序（thermalprotocol），包括温度、时间、循环次数等参数的设置。4编辑程序窗口，设置读板选择显示项，点击激活点击CreatNew：出现与Edit相同的界面，同样操作。给所设定的程序命名，点击Save&ExitProtocolEditing，退出此界面。2）点击PlatePlate，此窗口出现绿色框，点击Edit（编辑）或CreatNew（创建新程序）。设置反应板设置文件名称，写注释语，设置反应体系体积、所用盖类型（未设定的、膜、平盖或凸盖）、管型（
7、未设定的、板、8连管或单管）。反应管设置文件备注反应体积盖类型管类型下面设置反应管在96孔中的放置位置，选择本次实验使用哪些孔、样品类型（sampletype）以及要检测的荧光基团种类。如果样品类型是标准品的话，还要输入其对应的量5（拷贝数、稀释倍数、nmol、pmol、ng .）。96孔位置标准品未知品空白对照阳性对照阴性对照填充染料消除设置消除整板设置设置样本编号规律（3种），重复样数，下一个编号，荧光染料，选择和添加染料，标准品浓度设置点击CreatNew：出现与Edit相同的界面，同样操作。给所设定的程序命名，点击Save&ExitPlateEditing，退出此界面。3）运行：运行窗
8、口为绿框，显示选择的运行文件及注释，点击Run，系统切换到Run界面，在W elW WW elFactorFactorSourceSource中选择使用PersitentPersitentW elW WW elFactorFactor（永久校正因子，默认状态）。6点击BeginRun弹出对话框，将本次的数据记录文件（X.opd）命名并保存，点击OKOK正式开始运行。PCR循环开始，系统会打开Run-TimeRun-TimeCentralCentral模块对实验进行实时监控，在实验结束后，进入DateDateAnalysisAnalysis模式。实验结束后先关闭iQ5软件，再依次关闭电脑、光学检
9、测器及扩增系统电源。44数据分析在实验结束后，自动进入DateAnalysi模式，或在点击Workshop窗口下的，选中之前的实验文件，双击文件弹出分析模式窗口，此窗口下有6个子窗口，绿色为活动窗口，灰色为无活动窗口，默认窗口为PCRQuant，其它窗口需要点击进入。71）PCRQuant扩增曲线图标准曲线图（如果没有绝对定量，不显示）显示样品放置位置，选择项会在下图中直观显示，对扩增曲线取对数，显示、分析孔设置点击Result，弹出定量结果，包括Ct、未知品量、荧光信号强度等等，分析模式选择在荧光曲线图与标准曲线图下方的表格中显示着与其相关的数据，内容包括样品序号、样品类型（Type）、Ct
10、值（ThresholdCycle）、起始模板量（StartingQuanity）等。82）熔解曲线分析（当有熔解曲线实验）点击MeltCurve/Peak，弹出下面窗口随温度增加，荧光信号降低荧光信号与温度的负导数图熔解曲线详细结果表93）终点分析点击EndPoint，弹出下面窗口，左边显示方法设置，颜色显示，分级；右边用表格形式显示各样品的详细信息及直观的颜色分级状况。104）等位基因分析（基因分型）图直观显示基因型，表格详细报告各样品分型信息，界面显示其它的分析显示选项。15）基因表达（相对定量）分析点击GeneExpr，弹出分析界面选择图中X、Y轴意义，选择内参基因、不同基因的表示颜色、是否在图中显示，选择参照处理、需要分析的样品孔，选择ddCt或dCt设定好上述参数后，点击Recalulate，弹出以下界面12显示基因表达差异选择对应各染料显示样品孔处理、基因定义及相应Ct值6）编辑板设置（样品设置）点击EditPlate，进入样品编辑界面，对分析数据进行重新设定。报告输出1）对所有的实验及分析结果：图形式结果：点击鼠标右键，Copy到Ofice文档中，或直接打印出来；表格结果：点击鼠标右键，直接打印出来，或导出以Excel文件保存。2）点击Report，弹出对话框，设定需要报告的内容，点击打印或输出文件保存，如下图显示。13
