1、药学分子生物学,第三章 转录及其调控,重点难点,转录、启动子、增强子的概念 转录反应体系 原核生物转录的大致过程 真核生物转录后加工 转录水平的调节方式 原核生物的操纵子模式 真核生物的顺式作用元件与反式作用因子,生物体在遗传信息传递过程中，以DNA为模板，在DNA依赖的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerase）催化下，以4种三磷酸核苷（ATP、GTP、CTP、UTP）为原料，合成RNA的过程称为转录（transcription）。,复制和转录的区别,目录,第一节 原核生物转录 第二节 真核生物转录 第三节 转录调控 第四节 转录及其调控系统与药物,第一节 原核生
2、物转录,目录,一、原核生物转录模板、酶及相关因子 （一）原核生物转录模板 （二）原核生物RNA聚合酶 （三）原核生物转录相关因子 二、原核生物转录过程 （一）原核生物转录起始 （二）原核生物转录延长 （三）原核生物转录终止,一、转录模板、酶及相关因子,在DNA分子的双链上，按碱基配对规律能指导转录生成RNA的一股链作为模板指导转录，另一股链则不转录，这种模板的选择性称为不对称转录（asymmetric transcription）。,（一）转录模板,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His
3、Val C,编码链（coding strand）,模板链（template strand）,mRNA,蛋白质,转录,翻译,一、转录模板、酶及相关因子,（二）原核生物RNA聚合酶 在模板链DNA碱基序列的指导下，按碱基配对规律把四种核糖核苷三磷酸聚合成RNA链。 需二价金属离子，如Mn2+、Zn2+。 不需要引物并且也没有校正活性。,一、转录模板、酶及相关因子,大肠埃希菌（Ecoli）RNA 聚合酶各亚基的功能,2称为全酶（holoenzyme），称为核心酶（core enzyme）。,一、转录模板、酶及相关因子,（三）原核生物转录相关因子,由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量46kD。 能
4、结合RNA，以对poly C的结合力最强，对poly dC/dG组成的DNA的结合能力低得多。 ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。,1.因子,一、转录模板、酶及相关因子,2.调节基因所编码的因子 特异因子 ：决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力； 阻遏蛋白：可识别、结合特异DNA序列，抑制基因转录，介导负调节； 激活蛋白：可结合启动序列邻近的DNA序列，提高RNA聚合酶与启动序列结合能力，增强RNA聚合酶的转录活性，是一种正调控。CAP,一、转录模板、酶及相关因子,分解代谢物基因激活蛋白（catabolite gene activator protein,
5、CAP）就是一种典型的激活蛋白。有些基因在没有激活蛋白存在时，RNA聚合酶很少或根本不能结合启动序列，无法转录。,3.其他因子 除上述因子外，还有一些蛋白质参与转录过程。例如，大肠埃希菌的nusA蛋白能协助RNA聚合酶识别某些特征性的终止位点。,一、转录模板、酶及相关因子,二、原核生物转录过程,（一）原核生物转录起始 1.原核生物RNA聚合酶与模板的辨认结合,原核生物通常是以操纵子（operon）作为转录和调控的基本单位。,RNA聚合酶保护法,二、原核生物转录过程,二、原核生物转录过程,开始转录,T T G A C A A A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T
6、 A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,RNA-pol辨认位点 (recognition site),2.原核生物转录起始过程 闭合转录复合体（closed transcription comple）形成； 开放转录复合体（open transcription complex）形成； 转录起始复合物形成。,二、原核生物转录过程,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,转录起始复合物:,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,二、原核生物转录过程,E.coli的转录起始和延长,（二）原核生物转录延长,二、原核生物
7、转录过程,1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,二、原核生物转录过程,大肠埃希菌的转录泡局部结构示意图,转录泡(transcription bubble)：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,二、原核生物转录过程,原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行,在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行； 转录尚未完成，翻译已在进行。,（三）原核生物转录终止 当RNA聚合酶核心酶（）滑行到操纵子的终止部位时，就在DNA模板上停顿下来
8、不再前行，转录生成的RNA产物链从转录复合物上脱落下来，即转录终止（termination）。 原核生物转录终止包括依赖因子的与非依赖因子的二种转录终止机制。,二、原核生物转录过程,二、原核生物转录过程,1.依赖因子的转录终止,二、原核生物转录过程,2.非依赖因子的转录终止,第二节 真核生物转录,目录,一、真核生物转录酶及相关因子 （一）真核生物RNA聚合酶 （二）真核生物转录相关因子 二、真核生物转录过程 （一）真核生物转录起始 （二）真核生物转录延长 （三）真核生物转录终止,三、真核生物RNA成熟 （一）真核生物mRNA的成熟 （二）真核生物tRNA的成熟 （三）真核生物rRNA的成熟 （
9、四）非编码RNA的加工成熟 （五）RNA编辑,一、真核生物转录酶及相关因子,真核生物的RNA种类 编码RNA（mRNA） 非编码RNA 管家非编码RNA：直接或间接参与蛋白质合成 （tRNA，rRNA，snRNA，snoRNA等） 调控非编码RNA 短链非编码RNA（非编码小RNA） 中链非编码RNA 长链非编码RNA,一、真核生物转录酶及相关因子,（一）真核生物RNA聚合酶,一、真核生物转录酶及相关因子,是真核生物中最活跃的RNA聚合酶； 最大亚基肽链的C末端氨基酸残基序列为（YSPTSPS）n。不同生物种属的n值不同，一般在2060。主要由含羟基氨基酸组成的重复序列，称为羧基末端结构域（c
10、arboxyl terminal domain，CTD）。CTD上的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基可被蛋白激酶作用发生磷酸化，在从转录起始过渡到延长时有重要作用。,RNA聚合酶,一、真核生物转录酶及相关因子,（二）真核生物转录相关因子 1.转录因子 在真核细胞核中，能够协助RNA聚合酶转录RNA的蛋白质被统称为转录因子（transcriptional factor，TF）。 人类基因组约编码2 000种转录因子。真核生物转录因子种类很多，有多种分类方式。,参与RNA-pol转录的TF的作用,一、真核生物转录酶及相关因子,2.其他因子 与启动子上游元件结合的蛋白质，称为上游因子 （upstream
11、factor）。上游因子可协助调节转录的效率。 与远隔调控序列如增强子等结合的反式作用因子； 在某些特殊生理或病理情况下被诱导产生的可诱导因子。,二、真核生物转录过程,（一）真核生物转录起始 真核生物的转录起始阶段，主要是RNA聚合酶、转录因子TF与DNA模板形成转录起始前复合物（pre-initiation complex，PIC）的过程,二、真核生物转录过程,（二）真核生物转录延长 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,二、真核生物转录过程,（三）真核生物转录
12、终止 真核生物的转录终止与转录产物的加工密切相关。 真核生物RNA聚合酶转录产生hnRNA的过程，直至出现多聚腺苷酸信号为止，即转录终止的修饰点序 成熟mRNA的5端“帽子”结构和3端的poly A尾是在加工过程中产生的,三、真核生物RNA成熟,在真核生物中，几乎所有的初级转录产物都需一定程度的加工才能成为具有生物学功能的RNA分子 真核生物初级转录产物的成熟主要在细胞核内进行。 成熟过程包括核苷酸的部分水解、剪接反应、5端和3端的“加帽”和“加尾”，以及核苷酸的修饰等。,三、真核生物RNA成熟,几种主要的修饰方式：,1. 剪接(splicing),2. 剪切(cleavage),3. 修饰(
13、modification),5. RNA编辑(RNA editing),4. 添加(addition),三、真核生物RNA成熟,（一）真核生物mRNA的成熟 1.mRNA的剪接 去除初级转录产物上的内含子，把外显子连接起来使之成为成熟mRNA的过程称为剪接。 剪接过程中内含子区段弯曲，使相邻的两个外显子互相靠近而利于剪接，称为套索RNA。 内含子近3端的嘌呤甲基化是形成套索所必需的。 大多数内含子序列的5端都以GU开始，而以3端AG-OH结束。5-GUAG-OH-3称为剪接接口（splicing junction）或边界序列。,三、真核生物RNA成熟,hnRNA的剪接发生在剪接体（splice
14、some），自20世纪70年代后期RNA剪接现象发现以来，科学家们一直在探索其中的分子奥秘，中国科学家施一公研究组2015年8月21日，在科学(Science)发表论文阐述了单颗粒冷冻电子显微技术（冷冻电镜）解析的酵母剪接体近原子分辨率的三维结构，并在此结构基础上分析了剪接体对前体信使RNA执行剪接的基本工作机理。,三、真核生物RNA成熟,剪接体的装配和剪接过程,三、真核生物RNA成熟,剪接过程需两次转酯反应,三、真核生物RNA成熟,2. mRNA 5端“加帽”和3端“加尾” 绝大部分真核细胞成熟mRNA的5端通常都有一个以7-甲基鸟嘌呤-三磷酸核苷（m7G-5ppp5-N-3）作为起始结构的
15、“帽子”结构，3端有一段长为80250个核苷酸的多聚腺苷酸（polyA）尾。5端“帽子”结构和3端多聚腺苷酸尾是通过对mRNA前体的加工形成的，并且都先于中段的剪接过程。,三、真核生物RNA成熟,mRNA的5端帽结构,三、真核生物RNA成熟,mRNA的5端帽结构的形成,AAUAAA,G/U,5,3,Poly(A)信号,Poly(A)位点,mRNA,CPSF,G/U,5,3,CPSF,CFI,CFII,CStF,CPSF,CStF,CFI,CFII,PAP,CPSF,CStF,CFI,CFII,PAP,ATP,多聚腺苷酸尾的形成,三、真核生物RNA成熟,（二）真核生物tRNA的成熟,DNA,tR
16、NA前体,三、真核生物RNA成熟,三、真核生物RNA成熟,碱基修饰,三、真核生物RNA成熟,（三）真核生物rRNA的成熟,三、真核生物RNA成熟,（四）非编码RNA的加工成熟 1.lncRNA lncRNA结构上类似于mRNA，但序列中不存在开放阅读框。许多已知的lncRNAs由RNA聚合酶催化转录并经可变剪切形成，通常被多聚腺苷酸化。 2.短链非编码RNA 短链非编码RNA又称为非编码小RNA，这些RNA除了具有催化活性的RNA（核酶）、细胞核小分子RNA(snRNA)以及核仁小分子RNA（snoRNA）以外，目前人们广泛关注的非编码RNA还有miRNA和siRNA。,三、真核生物RNA成熟
17、,miRNA 是一类长度在22nt左右的内源性snoRNA。由一股具有发夹环结构的前体加工后形成。转录合成是由RNA聚合酶负责催化的。 siRNA是生物宿主对于外源侵入基因表达的双链RNA进行切割所产生的具有特定长度（21-23bp）和特定序列的小片段RNA。siRNA是由细胞内一类双链RNA，通过酶切转变而来。,三、真核生物RNA成熟,（五）RNA编辑 有些蛋白质产物的氨基酸序列并不完全与基因的编码序列相对应。研究发现，某些mRNA前体的核苷酸序列经过编辑过程发生了改变。所谓RNA编辑（RNA editing）是指在mRNA水平上，通过核苷酸的缺失、插入或替换而改变遗传信息的过程。 通过RN
18、A编辑，使得一个基因可以产生多种氨基酸序列不同、功能不同的蛋白质，RNA编辑的结果不仅扩大了遗传信息，而且使生物能更好地适应生存环境。,第三节 转录调控,目录,一、原核生物转录调控 （一）原核生物转录调控的特点 （二）原核生物转录起始调控 （三）原核生物转录终止调控 二、真核生物转录调控 （一）真核生物转录调控的特点 （二）真核生物转录前调控 （三）真核生物转录水平调控 （四）真核生物转录后调控,一、原核生物转录调控,（一）原核生物转录调控的特点 因子识别的特异性：在转录起始阶段，亚基识别特异启动子，不同的因子决定特异基因的转录激活。 操纵子学说的普遍性：操纵子学说在原核基因的表达调控中具有普
19、遍意义。 负性调节的主导性：特异的阻遏蛋白对操纵子基因转录起始的阻遏机制即负性调节十分普遍。,（二）原核生物转录起始调控 1乳糖操纵子的诱导型调控,一、原核生物转录调控,1）乳糖操纵子(lac operon)的结构,2）乳糖操纵子的转录调控机制 （1）阻遏蛋白的负性调节：,一、原核生物转录调控,（2）CAP的正性调节,一、原核生物转录调控,无葡萄糖，cAMP浓度高时,有葡萄糖，cAMP浓度低时,（3）协调调节,一、原核生物转录调控,2.色氨酸操纵子的阻遏型调控,一、原核生物转录调控,（三）原核生物转录终止调控,一、原核生物转录调控,色氨酸操纵子转录的衰减调节,（一）真核生物转录调控的特点 1.
20、有多种RNA聚合酶：RNA pol 、 2.转录激活状态的染色质结构发生明显变化 对核酸酶敏感； DNA拓扑结构变化； DNA碱基的甲基化修饰变化； 组蛋白变化 3.正性调节占主导,二、真核生物转录调控,（二）真核生物转录前调控 1.染色体结构对转录的影响 常染色质上，结构比较疏松的DNA能很活跃地进行转录，而在高度凝缩的异染色质上很少出现RNA的合成。 2. DNA的修饰 转录活跃区则很少甲基化，而不表达的基因则高度甲基化。 3. 组蛋白的修饰 组蛋白的修饰直接影响染色质或核小体的结构，同时也可能募集了其他调控基因转录的蛋白质，为其他功能分子与组蛋白结合搭建了一个平台。,二、真核生物转录调控
21、,DNA和组蛋白的修饰都是在基于非基因序列改变基础上导致了基因表达的变化，通常把这种研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传变化称为表观遗传学。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化，基因组印记，母体效应，基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑等。,二、真核生物转录调控,（三）真核生物转录水平调控 1.真核生物转录起始调控 （1）顺式作用元件： 1）启动子：指RNA聚合酶结合位点及其周围的一组转录调控组件。,二、真核生物转录调控,2）增强子 增强基因转录的效应明显； 作用方式与其方向，或与其所在部位与转录起始点的距离无关； 多数为重复序
22、列，有完整或部分回文结构； 效应有严格的组织细胞特异性； 没有基因专一性； 活性与其在DNA双螺旋中的空间方向性有关； 许多增强子是否发挥作用受外部信号驱使。,二、真核生物转录调控,3）沉默子：沉默子是一类负性转录调控元件。与增强子的作用恰恰相反，当其结合特异蛋白因子时，对基因的转录发挥抑制作用。已有的证据显示沉默子与增强子类似，其作用亦不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用。,二、真核生物转录调控,（2）反式作用因子 真核细胞核中大多数的转录因子皆以反式作用的方式调节基因转录。,二、真核生物转录调控,1）转录因子的DNA结合域 锌指结构结合域,二、真核生物转录调控,常结合GC盒,C=半胱氨酸
23、；H=组氨酸；F=苯丙氨酸；L=亮氨酸；Y=酪氨酸； Zn=锌离子,锌指结构,亮氨酸拉链结构域,二、真核生物转录调控,常结合CAAT盒,（a）碱性亮氨酸拉链模体结构示意图；（b）bZIP模体与DNA结合的示意图。两个-螺旋上的亮氨酸残基彼此接近，形成了类似拉链的结构，而富含碱性氨基酸残基的区域与DNA骨架上的磷酸基团结合,碱性螺旋-环-螺旋结构域,二、真核生物转录调控,（a）独立的碱性螺旋-环-螺旋模体结构示意图；（b）bLHL模体二聚体与DNA结合的示意图。两个-螺旋的碱性区分别嵌入DNA双螺旋的大沟内,常结合CAAT盒,2）转录因子的转录激活域： 一般由30100个氨基酸残基组成。 根据氨
24、基酸组成特点，转录激活域分为如下4种类型： 富含谷氨酰胺的结构域； 富含脯氨酸的结构域； 带负电荷的-螺旋结构域； 含有双性-螺旋和酸性氨基酸的结构域。,二、真核生物转录调控,（3）真核生物转录起始复合物的形成,二、真核生物转录调控,2.真核生物转录终止调控 （1）HIV基因组转录终止调节 抗转录终止机制与病毒蛋白Tat有关。（2）热休克蛋白基因的转录终止调节 热激转录因子快速地由无活性转变为活性状态。,二、真核生物转录调控,（四）真核生物转录后调控 1.mRNA的稳定性 所有RNA类型中，mRNA寿命最短。mRNA稳定性是由合成速率和降解速率共同决定的。 大多数高等真核生物细胞mRNA半衰期
25、较原核生物长，一般为几个小时。 mRNA的半衰期可影响蛋白质合成的量，通过调节某些mRNA的稳定性，即可使相应蛋白质合成量受到一定程度的控制。,二、真核生物转录调控,2.转录后基因沉默 成熟的miRNA可以与其他蛋白质一起组成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），通过与其靶mRNA分子的3端非翻译区域（3UTR）互补匹配，再以目前尚不清楚的机制抑制该mRNA的基因表达。 双链的siRNA也参与RISC组成，与特异的靶mRNA完全互补结合后，能够导致靶mRNA降解，阻断其进一步的基因表达。这种由siRNA介导的基因表达抑制作用称为RNA干
26、扰（RNA interference，RNAi）。,二、真核生物转录调控,第四节转录及其调控系统与药物,目录,一、与DNA形成复合体从而影响转录的药物 （一）放线菌素D （二）蒽环类抗肿瘤药 （三）原核生物转录终止调控 二、选择性结合原核生物RNA聚合酶的药物,（一）放线菌素D 又称更生霉素，抗肿瘤药物，分子的苯氧环连接两个等位的环状肽链。肽链与DNA分子的脱氧鸟嘌呤发挥特异性相互作用，使放线菌素D嵌入DNA双螺旋的小沟中，与DNA形成复合体，阻碍RNA聚合酶的功能，抑制RNA的合成，特别是mRNA的合成。,一、与DNA形成复合体从而影响转录的药物,（二）蒽环类抗肿瘤药 药物分子能嵌入到DNA
27、的双链中形成稳定复合物，影响DNA的功能，阻止DNA复制和RNA的转录；还具有抑制拓扑异构酶功能，引起DNA断裂；对DNA依赖性RNA聚合酶也有抑制作用。在细胞内还可形成自由基，造成细胞膜及其他细胞器的损伤。 包括多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、 阿柔比星（aclambicin）、米托蒽醌（mitoxantrone）和表柔比星（epirubicin）等。,一、与DNA形成复合体从而影响转录的药物,（二）蒽环类抗肿瘤药,多柔比星,柔红霉素,伊达比星,阿柔比星,利福霉素类抗生素 利福霉素类药物可以选择性的与原核生物的依赖DNA的RNA聚合酶的亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成，防止该酶与DNA连接，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止。,二、选择性结合原核生物RNA聚合酶的药物,利福霉素类抗生素,小结,1. 转录相关的概念 2. 转录所需反应体系 3. 转录反应过程 4. 真核生物转录后加工 5. 转录的调控 6. 转录与调控相关药物,Thank You!,
