1、病原微生物应急检测柯昌文广东省疾病预防控制中心一、病原微生物引起的传染病我国传染病法规定的法定报告传染病分类：甲、乙、丙3类，从数量上共有39种，主要由病毒、细菌和寄生虫引起。（一）甲类传染病主要鼠疫和霍乱。（二）乙类传染病 （1）病毒引起的：传染性非典型肺炎、人感染高致病性禽流感、新型甲型 H1N1流感、麻疹、病毒性肝炎、艾滋病、脊髓灰质炎、流行性出血热、狂犬病、流行性乙型脑炎。（2）细菌引起的：伤寒和副伤寒、淋病、梅毒、百日咳、白喉、流行性脑脊髓膜炎、猩红热、钩端螺旋体病、布鲁氏菌病、炭疽、肺结核、新生儿破伤风。（3）寄生虫和细菌：疟疾、血吸虫病、细菌性和阿米巴性痢疾。（三）丙类传染病（1
2、）病毒引起的主要有：流行性感冒、流行性腮腺炎、急性出血性结膜炎、手足口病、风疹及除霍乱、痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻病。（2）细菌和寄生虫引起的：麻风病、流行性和地方性斑疹伤寒、黑热病、丝虫病、包虫病。（四）病原微生物引起的综合征1、急性腹泻综合征（1）细菌性腹泻：霍乱弧菌、志贺氏菌、大肠杆菌（肠毒素性和肠出血性） 、沙门菌、空肠弯曲菌、小肠结肠耶尔森菌、艰难梭菌等。（2）病毒性腹泻：轮状病毒、诺如病毒、腺病毒、埃博拉和其他出血热病毒等。（3）寄生虫性腹泻：痢疾阿米巴、隐孢子虫、贾迪鞭毛虫等。2、急性出血热综合征登革热病毒、汉坦病毒、克里米亚-刚果热病毒、埃博拉病毒、拉萨热病毒、马尔堡出
3、血热病毒、裂谷热病毒、南美沙粒病毒、蜱传播的黄病毒、黄热病病毒等。3、急性黄疸综合征A，B，E 型肝炎病毒、钩端螺旋体、黄热病病毒等、4、急性神经性综合征(1)细菌性脑膜炎：脑膜炎奈瑟氏菌、钩体、肺炎链球菌、嗜血流感杆菌、大肠杆菌、李斯特菌等。(2)病毒性脑炎：乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒、肠道病毒、蜱传播的脑炎病毒等(3)寄生虫性脑炎：锥形虫、疟原虫等。5、急性呼吸综合征（1）细菌性：炭疽杆菌、鼠疫杆菌、百日咳杆菌、白喉杆菌、A 群链球菌、TB、军团菌、支原体、衣原体等。（2）病毒性：冠状病毒、流感和禽流感病毒、肺综合征汉坦病毒和腺病毒等。6、急性皮肤综合征水痘病毒、麻疹病毒、风疹病毒
4、、肠道病毒71、柯萨奇病毒 A 组16型、斑疹伤寒立克次氏体、炭疽杆菌、猴豆病毒、细小病毒 B19、基孔肯雅热病毒等。7、急性眼综合征腺病毒、肠道病毒、沙眼衣原体8、急性全身性综合征炭疽杆菌、鼠疫杆菌、布氏菌、伤寒沙门菌、钩体、HIV、登革病毒、汉坦病毒、疟原虫莱姆病螺旋体。二、应急检测的目的和意义应急检测的目的和意义是1、识别暴发、确定病因2、确定传染来源3、确定传播链和流行范围4、发现新的病原微生物5、提供仲裁依据三、病原微生物的特点及其应急检测病毒不是完整的生物体，结构简单，需要再电子显微镜下才能看清楚。电镜是研究病毒和细胞相互作用的重要工具，但是在诊断实验室的使用却非常有限。要想直接用
5、电镜观察检测病毒，样品必须含有高滴度的病毒颗粒（106到107个 / ml）但也可通过样品浓缩和使用标记抗体提高敏感性。电镜主要用于不可培养的病毒检测，特别是病毒性胃肠炎病原体检测。细菌的诊断相对容易，培养也较方便。（一）病原微生物及其抗原和核酸的检测方法和初步结果报告时限1、分离培养（细菌：4872小时，病毒1428天）2、免疫荧光法（48小时）3、固相免疫分析胶体金法（3060分钟）4、酶联免疫分析（ELISA) （48小时）5、核酸扩增聚合酶链式反应（PCR） （48小时）6、实时荧光 PCR （34小时）7、核酸序列分析（1624小时）8、形态学诊断（ 2472小时）二）血清学抗体检测
6、方法和初步结果报告时限1、ELISA 检测感染早期 IgM 抗体（ 48小时）2、ELISA 检测感染急性期和恢复期 IgG 抗体（48小时）3、病毒抗体中和试验测定急性期和恢复期中和抗体（7天）4、血球凝集抑制检测病毒抗体（48小时）5、试管凝集试验检测细菌抗体（48小时）6、间接血球凝集抑制试验检测病毒抗体（48小时）7、补体结合试验（2448小时）（三）选择检验方法需考虑的因素1、疑似病原微生物感染的病理学知识2、病人感染的病程和采样时间3、各种方法对疑似病原微生物感染的适用性4、可用于检测标本类别（四）实验室结果的意义和解释1、病原微生物感染的实验室诊断需要多方面的信息，包括：对可疑病
7、原体的致病机理的理解，对感染阶段的认识，被感染者的年龄和免疫状况等。2、病原微生物分离培养的成功与多个因素有关，包括：选择适当的标本，仔细收集标本以最大限度收集到致病因子，标本的运输必须尽量保持病原体活性，减少污染菌的增殖等。3、如果从疑似病人的标本中分离到目标细菌和病毒，可以确诊。4、如果在疑似病人的标本中检测到目标细菌和病毒核酸，可以确诊。5、如果目标病原微生物感染的中和抗体或 IgG 抗体或其他方法测定的抗体滴度稳定维持在高水平，或者出现阳转血清抗体滴度，或是恢复期血清的抗体滴度比急性期有4倍或4倍以上的增长，则表明病人确有感染相应病原体。6、如病人血清或脑脊液标本中检测到目标病原微生物
8、感染的 IgM 抗体阳性，表示有近期感染、7、如果脑脊髓液标本或血清 IgM 抗体检测阴性，可能是因为患者体内的抗体还没达到可被检测的浓度，需结合发病和采样日期，进一步对患者的血清标本进行检测。三、应急检测标本的采集和运输（一）标本的选择1、为了说明病原体与某种特殊疾病的关系，标本应尽可能取自靶器官2、许多病原微生物感染的临床症状可以用来确定靶器官，以取得适当的标本3、分离立克次氏体的标本种类有限，主要是血液和内脏组织（二）采样器材1、无菌、耐低温、密闭带螺口盖的容器。包括尿杯和一次性离心管（1550ml） ，适于盛装24mlVTM的标本收集管，25ml 血清收集管2、无菌棉签和专用采样拭子3
9、、无菌玻珠(直径5mm)每管加34个玻璃珠，以便于将结合在拭子上的细胞释放出来4、注射器配26和27号针头，用于吸取囊泡液5、含抗凝剂的血液收集管（三）病毒运输液（VTM）1、运输液可以防止标本干燥，在标本收集和接种的间隔期内有助于保持病毒活性，同时延缓污染菌的增殖。2、使用的 VTM 有多种配方，VTM 既可在实验室自行配制，也可以购买商品化的，尽管综合性的研究不多，但使用不同的 VTM 对选择的病毒的回收检测结果没有显著影响。（四）细菌运送培养基1、维持活力，不增菌的非营养性半固体培养基2、四种主要运送培养基：Stuarts、 Cary-Blair、 Amies、 STGG（五）标本收集1
10、、出现临床症状后尽可能早地采集标本，最好在没有进行抗病毒和抗生素治疗之前采集。2、最易分离到病毒的时间是发病后3天内，5天以后分离到病毒的机会将大大降低。病例死亡后应尽快采集尸解标本。3、收集立克次氏体培养标本应尽量无菌。4、详细询问病史，包括发病日期、临床表现、近期暴露史、动物和节肢动物接触史和叮咬史、近期到流行区的旅行史和疫苗接种史。5、用于细菌血培养的标本应尽早采集，并注意无菌操作。（六）标本的运送、接收与保存1、专人负责标本运输2、新鲜的临床采集标本应在4条件下24小时内运送至实验室；未能24小时内送至实验室的，应置-70或以下保存3、冻存的标本应使用干冰或液氮送检，低温送至实验室4、
11、标本核对无误后置-70冰箱保存，并做好相应的记录（七）标本的盛装1、盛装标本的容器应坚固、密封、无菌2、容器的材料要求“两耐三防” ：耐高（低）温耐高压、防水、防破损、防泄漏3、容器上贴规范的标签以利于识别4、样品的有关表格和或说明应单独放置于防水的袋子里以防发生污染，不要绑在容器外（八）容器的外包装1、外包装内有吸水性材料和干冰、热水袋等保温性材料2、外包装上应有生物安全标识（九）标本的接收1、大规模接收标本的实验在专用房间或区域进行2、接收由2人同时完成，接收人员应受过防护培训。明确所操作标本的潜在健康危害，采取防护措施。3、检查容器的外观和标签是否完整、标签与内容物：是否相符、是否有污染
12、及容器是否破损等，并登记标本接收登记表 ，记录处置方法。4、对于容器破损、有液体外渗或怀疑污染的样品，可以拒绝接收，嘱其再次采集样品送检。（十）标本包装的打开1、标本应在生物安全柜中打开包装，同时备有适当的消毒剂以便处理可能出现的标本泄漏。2、操作人员应穿防水的防护服，戴生物安全专用口罩、眼罩和手套。（十一）标本的保存专人负责保存1、保存者需对照标本送检单，核对标本数量、送检状态、标本编号，并填写标本保存登记表 。2、不同标本按照不同存放要求分类存放，同时填写标本存放登记表 。5种常见标本分别是血培养标本、血清标本、尿液标本、痰标本和鼻咽拭子标本。（一）血培养标本1、用70%乙醇擦拭血液培养瓶
13、，分别包装后于室温环境下立即送往实验室（冬季需保温） ；如果不能及时送检，置于室温，勿放冰箱2、标本接收单位在接到标本后，首先应检查血培养物状态及运输温度记录，确认温度记录无误血培养物状态良好后及时进行培养（二）血清标本1、新鲜的血清标本可在4条件下运输，冷冻的血清标本需在保持冻存的状态下运输2、需长期保存的标本应置于-70 冰箱（三）尿液标本1、新鲜标本在4条件下运输，冷冻的标本需在保持冻存的状态下运输2、标本接收单位在接到标本后，首先应检查标本状态，填写标本接收登记表 ，并立即进行尿抗原检测3、需长期保存的标本应置于-70 冰箱（四）痰标本1、采用专用采痰盒采集痰液，并注意送检期间的安全防
14、护2、标本需及时送检以避免干燥，不能及时送检者可暂存4冰箱内12小时。不可在室温下放置过长时间3、标本接收单位在接到标本后，首先应检查痰标本状态，填写标本接收登记表 ，确认痰标本状态良好后及时进行培养4、接收标准，目测：黄色、灰色、血性、铁锈色、浑浊、稠厚呈现团块状的标本为合格标本；而无色透明有灰白片状物或黑色小点、有明显食物渣滓、纸屑或灰尘等为不合格标本。显微镜下：取约0.1ml 痰液用接种环均匀涂布成22cm 大小的涂膜，在显微镜下合格痰标本的涂片镜检，鳞状上皮细胞10个/低倍视野白细胞25个/低倍视野，或两者比例小于1：2.5为合格标本，可进行细菌培养（五）鼻咽拭子标本1、未能24小时内
15、送至实验室的，应置-70或以下保存2、冻存的标本应用干冰在保持冷冻的条件下，低温送至实验室3、标本核对无误后，置-70冰箱保存4、新鲜采集的标本应立即放置于冰盒或在4条件下保存，并于24小时内运送至实验室四、应急检测案例分析（一）2010年东莞基孔肯雅热暴发疫情（1）10年9月30日傍晚，东莞市长热线接到万江区新村社区发热伴关节痛病人近期增加很多。（2）10月1日上午，东莞市疾控中心派员调查，并采集15份血清标本送市 CDC 实验室进行登革热抗体和核酸检测，结果不支持登革热诊断。（3）步查明原因，10月1日17时与省疾控中心沟通，并立刻将血清标本上送省中心进行登革热复核和基孔肯雅热等病毒核酸检
16、测。（4）月2日凌晨0时，省疾控中心检测结果显示15份标本中有10份检测到基孔肯雅病毒核酸，登革热病毒核酸均为阴性。（5）市疾控中心遂于10月2日凌晨通过突发公共卫生事件管理系统报告了该起事件。1、流行病学调查（1）回顾搜索调查：新村社区所辖的江村一组和二组自7月开始搜查；其余村组自9月1日开始搜查（2）查结果a.首例疑似病例9 月1日出现在江村b.9月上中旬在江村一组和二组有零星散在疑似病例发生c.9月下旬病例急剧增加，并波及至江村一、二组以外的其他村组2、东莞市 CDC 早期实验室检测情况（1）9月7日东莞市 CDC 实验室收集到新村5例发热伴关节痛和皮疹的病人血清标本（2）9月8日进行登
17、革热抗体和核酸检测，结果阴性（3）流行病医生根据结果排出了登革热3、反映的问题（1）疾病监测系统不敏感（2）公共卫生专业技术人员应对新发传染病的意识不强（3）地市级公共卫生实验室能力不足（4）未建立参比实验室服务体系、服务能力不足（二）2011香港猩红热爆发（1）2011年6月香港宣布该地区猩红热爆发，并出现2例死亡病例（2）实验室检测发现有多种基因型的 A 群链球菌菌株在社区循环并引起猩红热（3）通过调查香港认为猩红热病例增加可能是局部现象（4）本次爆发病例的流行病学和临床特征与以往的病例相似（5）病死率与历史数据和国际上报道的数据相比也没有显著增高广东省2011年猩红热病例异常增加，由往年
18、的200例，300例增加到1300多例。疾控中心从医院手机菌株和标本，进行实验室应急检测，发现菌株的耐药谱增加，带有独立基因。与香港的不一样。反映的问题：（1）2011年与往年相比法定传染病报告系统报告的猩红热病例明显增加，但没有引起重视，公共卫生部门对传染病报告信息不敏感（2）医院有基本的病原学检测能力，但实验室检测信息未充分共享（3）大部分临床实验室较少开展传染病病原学诊断（4）治疗没有实验室依据主要依赖抗生素（5）公共卫生实验室缺少临床标本和临床细菌分离株（三）案例总结（1）及时确定病因是科学有效控制传染病的关键，应加强实验室建设（2）临床和公共卫生实验室必须有足够的能力，特别是公共卫生实验室必须有很强的参比服务能力，更好地服务于传染病防控（3）提高传染病信息报告系统敏感性，及时发现暴发疫情，并开展应急检测（4）及时公开信息和发布预防控制指南是有效控制疫情和避免社会恐慌的关键五、总结1.病原微生物引起的传染病种类多，新的传染病病原不断出现2.实验室核心能力是应急检测成功的关键3.正确采集的合格的标本是应急检测的基础4.生物安全培训和安全防护设施是应急检测的保障5.传染病，特别是新发传染病严重威胁着人类健康和社会稳定
