1、问题可能原因解决方法1、无颜色试剂孵育的时间没有按说明书操作。确定生物素化抗体，连接的 HRP 试剂或链霉亲和素-HRP 使用的时间是否适当。2、不同试剂盒或不同批号的试剂混用。重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。3、漏加酶检查操作流程，注意不要漏加5、HRP 酶污染了叠氮钠使用新配制的试剂，禁含叠氮钠标准品有问题(若在标本孔中有信号)按说明书检查标准品的制备使用 1 瓶新标准品某一容器未洗净,残留灭活酶物质尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体重新确认所选用的试剂.漏加显色剂 A 或 B加显色剂后观
2、察一下液面高度试剂配制/使用有误将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。缓冲液污染配制新新鲜的缓冲液显色弱超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。检查产品的有效期加入试剂的体积和时间有误确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。试剂、样品用前未能平衡用前试剂、样品置室温平衡 10 分钟左右缩短孵育时间能使实验的信号变弱。检查孵育的时间。在温度变化的环境内孵育酶标板。确定孵育的温度，应避免温度的变化。使用了被污染的试剂检查试剂是否被污染。标准品/标本制备方法不规范检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。样品
3、用 NaN3 防腐,抑制了酶的反应显色底物制备不规范检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。检测时间不当是否在规定的时间内检测。仪器设定不正确，滤光片不匹配。仪器是否设定正确，滤光片的使用等。高背景(本底)洗涤操作不规范洗板不充分，使用手工洗板常出现。最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。板的内侧不应接触设备。检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。在两次洗板之间加 30 秒的浸泡。实验中孵育温度和时间不适当确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当酶加量过多加酶前验看移液器调节量是否准确。检
4、查稀释度，若必要进行效价测定。封闭不完全检查封闭液的计算量；提高封闭时间。标本或标准品中的干扰物质做适当的对照显色剂受光照时间较长,或污染显色剂 A 和 B 应于使用前 10 分钟从冰箱取出整批样品放置时间过长,样品污染样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染缓冲液污染制备新鲜的缓冲液吸头重复使用,未洗净或消毒不完全而用于加酶或显色剂吸头尽可能一次性使用太多的信号：全部的板子变成规则的蓝色不充分的洗涤/洗涤步骤被遗漏-没结合的过氧化物酶仍有残留。最好使用洗板机充分洗涤检查孔内是否有残留的洗液或加样量是否准确。底物溶液混合太早并转成蓝色应控制底物混合的时机并立即使用太多的酶结合物检查稀释度，必要时进
5、行效价测定封板膜或试剂容器被重复使用，导致 HRP 残留，使 TMB 底物产生非特异蓝色。使用新鲜的封板膜，每步使用不同的试剂容器缓冲液中污染金属或 HRP制备新鲜缓冲液高 CV 值(CV：coefficient of variation)，花板操作不慎或洗涤不充分按说明书洗板、加样、显色。洗板尤为重要，如上所述出现干板，没有使用封板膜、封板膜重复使用确定每两步骤间，酶标板应保持湿润。使用封板膜封口，注意每步使用新鲜的封板膜。由于操作失误或板子质量差(结合不均匀)造成包板不均匀。稀释用的 PBS 中不要加其它蛋白检查包被和封闭液体积、时间和试剂加入的方法。 检查所使用的酶标板，使用 ELISA
6、 板子(不要使用组织培养板)移液器不准确，吸头重复使用。检查并校准移液器。每次取样必须换吸头。回顾标本的加入步骤，确保每次加样的准确性，保证吸取的液体按所设定的体积吸入和排出，连续加样时注意检查吸头，确保所加液体的体积。样品离心处理不全,反应孔内发生凝血或残留细胞成分标本充分离心, 3000rpm 6 分以上，严禁使用凝血(溶血)的标本缓冲液污染制备新鲜的缓冲液标准曲线可得到，但两点之间区别很差(低或平的曲线)酶结合物不足检查稀释度，必要时进行效价测定捕获抗体没有很好结合到板上检查所使用的酶标板，使用 ELISA 板子(不要使用组织培养板)稀释用的 PBS 中不要加其它蛋白检测抗体不足检查稀释
7、度，必要时进行效价测定板子显色不足延长底物孵育实验使用推荐品牌的底物溶液操作不慎回顾 ELISA 操作流程，消除任何擅自修改的程序。标准曲线稀释度计算有误核查计算的情况，制备新的标准曲线标准曲线很好，但是没有任何期望的阳性信号产生在标本中无相应的细胞因子使用内参对照重复实验，重新考虑实验的相应参数标本基质遮盖检测将标本至少做 12 相应的稀释，或进行系列稀释观测它的恢复性标准曲线很好，但是标本的判读值很高标本中含的细胞因子水平超过实验范围将标本做稀释并再次实验当使用 HRP 酶结合物时，TMB 底物加终止液后显绿色孔中的试剂显色不充分轻轻振荡板子边缘效应工作环境温度不均衡避免将板子在变化温度环
8、境中孵育漂移实验过程中出现间断整个实验应连续操作：在实验开始前将所有标准品和标本做适当的准备试剂没有按说明书平衡至室温在所有试剂加入孔前，确保它们已平衡至室温，除非说明书中有另外的要求。是否可更改试剂盒 所提供的实验操作步骤？一般厂商为确保最高的灵敏度和特异性，对试剂盒都进行了优化，为确保每一试剂盒实验的规范性应按说明书操作。是否可混用不同试剂盒中的试剂？不行。绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异的，若有问题可与厂家或代理商联系。是否可增加或减少标本的体积。商品化的试剂盒所需加入的标本体积是优化的，应按说明书操作，不建议更改所加标本的体积。是否可重确定自己的标准曲线的点？可以。说明书上有建议的制备
9、标准曲线时标准品的稀释度，可改变稀释倍数和增加曲线的点，但是必须在实验范围内，高于试剂盒中最高标准品的点和低于灵敏度以下的点是无效的。ELISA 操作常见问题ELISA 方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但 ELISA 测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。引起 ELISA 测定错误结果的原因主要有：标本因素；试剂因素；操作因素。下面就一些常见 ELISA 操作过程中的问题一一分析。 1样品稀释 酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规
10、定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取 10l 样品进行稀释，个别用户取 5l 甚至 1l 样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。2试剂盒平衡 试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温(约 25) ，一般需在室温放置 2030 分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA 反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒置 37温箱
11、20 分钟。 3样品和试剂的混匀 稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。 4加样 在现在的 ELISA 商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。 5温育 温育是 ELISA 测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA 作为一种固相免疫测定
12、，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有 37和室温，其次是 43和 28 。一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。 6洗板 固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证 ELISA 测定的特
13、异性。洗板对于 ELISA 测定来说，也是极其关键的一步。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置 1 分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。 7边缘效应 使用 96 孔板的 ELISA 测定中，常发现有“边缘效应” ，即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规 ELISA 测定中，将板从室温（通常在 25左右）置于 37温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（
14、如 37），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。 8显色 显色一定要控制时间,根据试剂盒说明操作即可。一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。 9比色 比色要注意波长的选择。以 TMB 为底物和以 OPD 为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为 450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。 其次，单波长或双波长比色选择的问题。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如 450nm或 492nm 进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如 450nm 和非敏感波长如 630nm
15、 下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。由于 ELISA 测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在 ELISA 测定比色时，
16、最好是使用双波长比色。 综上所述，尽管 ELISA 测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。 1 问：请问对同样培养的相同浓度的细胞，用 ELISA 检测其上清液相同细胞因子的浓度，不同的报道差别为什么很大？参考解析：不同厂家的试剂盒当然有很大影响。ELISA 非常敏感，即使是同一个试剂盒，用同一个厂家同一浓度的刺激因子，incubate 时间不同也会影响结果，这就是为什么每次都要设内部和外部对照的原因。这主要和其抗体标准品原料来源有关，建议购买
17、 ELISA 试剂盒时选择大公司提供的产品，这样结果比较可靠一点。 2 问：ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么 ELISA 反应总是需要一定时间的温育？参考解析：温育常采用的温度有 43、37、室温和 4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度3 问：检测疫苗免疫小鼠后的抗体情况。用了商品化的试剂盒。1 商品化的板子已经用病毒裂解液包被了。2 洗 3 次后，将阳性和阴性血清（猪），样品血清（小鼠）1：40 稀释加入，留 2 个空做空白对照，30 分钟 37 度3 洗 3 次，在一个空白空中加入山羊抗小鼠二抗（1:1000
18、），一个加入商品化已稀释抗猪二抗（不知稀释倍数）。在阳和阴中加入抗猪二抗，样品中加入抗鼠二抗。4 洗 4 次。经加入底物 AB 侯显色 15 分钟。终止。测 630nm结果加入猪二抗的空白空为 0.277；阳性为 0.964，阴性为 0.503% 假如鼠二抗的空白空为 0.951：个样品都在 1.000 作用请问为什么两个空白空的值差那么多？是不是鼠二抗与包被的病毒抗原结合，还是二抗的稀释倍数不够？或者其他原因？参考解析：1 首先抗猪二抗和抗鼠二抗本来就是不同的东西（且稀释度不同），在没有非特异性结合出现的情况下，应该是 OD 值相差无几，但是从现在的结果看，肯定是二抗有非特异性的结合（这一点
19、从加入的样品鼠血清孔 与 鼠二抗空白孔差别不大也可以看出来），故造成两孔 OD 值差异。2 当然这么高的本底也有可能是你的抗体浓度使用稀释度不当或者洗板不彻底（残余大量未结合的酶标抗体）造成的，请首先查明。3 不知道你使用的是什么底物进行显色，好像常规 ELISA 实验的底物是没有检测波长在 630nm 的。4 排除了 2.3 两点的问题再考虑是否是二抗不纯并与包被的病毒裂解物结合的问题。你加入的商品化稀释的抗猪二抗，却不知道稀释度，这在 ELISA 实验中是不可取的，酶标抗体的浓度过高必然引起显色本底很高。 你可以取包被的板条不加样品直接加入梯度稀释的酶标记二抗，取 OD 值在0.1 以下时
20、的稀释度再进行检测。若检测值很低则是抗体的敏感性问题，应当更换其它抗体。4 问：请教一下，用双夹心 ELISA 法检测，用菌体免疫的小鼠和家兔，免疫后采集血清，可以直接包被血清吗，还是需要纯化后在包被？ 菌体与佐剂乳化时需要无菌操作吗？装血清用无菌操作吗？参考解析：血清不可以直接包被，主要是因为血清的 pH 和离子强度与通用的包被液不同，而且会造成一些非特异蛋白质的吸附，不利于特异性抗原或抗体的检测。纯化血清的方法很多，一般有盐析法和柱层析法，也可二者联合使用，视对纯度要求不同而异。一般盐析法（比如硫酸铵沉淀）纯化后就可获得主要的免疫球蛋白，而去除其他杂蛋白（如白蛋白等），如果需要进一步纯化的
21、话，还可用凝胶层析法或离子交换层析法来进一步纯化获得 IgG，如果抗原足够纯的话，也可以用亲和层析法来做，但这些实验会导致抗体效价的下降和免疫球蛋白的损失，所以要充分衡量利弊再做决定5 问：要在 balb/c 小鼠上，免疫蛋白，做个预实验，elispot 检测 CTL，elisa 检测抗体，我想不加强免疫，在第一次免疫一周后，就做能出结果吗？参考解析：加强免疫只是增加血液中抗体滴度，只是量的增加，理论上不影响定性检测。elisa 的敏感性很高，第一次免疫后，CTL 和抗体都应该能够检测到，但实际操作对实验结果影响很大，具体检测效果如何，你应该试着做做。本底及假阳性产生的原因分析1. 基因工程抗
22、原与合成肽抗原的区别基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。引起 ELISA 测定错误结果的原因主要有：1标本因素；2试剂因素；3操作因素。本文就标本因素对 ELISA 测定的影响做如下讨论。 血清是最常用的 ELISA 标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源 性物质和外源性物质两种： 1内源性物质 有人认为大约 40%的人
23、血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异 性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠 Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。 （1）类风湿因子 人血清中 IgM、IgG 型类风湿因子（RF）可以与 ELISA 系统中的捕获抗体及酶标记二抗的 FC 段直接结合，从而导致假阳性。 解决该情况的办法是：用 F(ab)2 替代完整的 IgG；标本用联有热变性（63，10 min）IgG 的固相吸附剂处理（将热变性 IgG 加入到标本稀释液中同样有效）；检测抗原时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本 稀释液中，使 RF 降解。 （2）补体 EL
24、ISA 系统中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其 FC 段的补体 C1q 分子结合位点被暴露出来，使 C1q 可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：用 EDTA 稀释标本；用53，10 min 或 56，30 min 加热血清使 C1q 灭活。 （3）嗜异性抗体 人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ig (s) 结合的天然嗜异性抗体，可将 ELISA 系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。解决的办法是：可在标本稀释液中加入过量的动 物 Ig (s) ，但加入量不足或亚类不同时无效。 （4）嗜靶抗原的自身抗体 抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶
25、抗原结合形成复合物，在 ELISA 方法中均可干扰抗原抗体测定结果。 为避免以上情况出现，解决的办法是：测定前需用理化方法将其解离后再测定。（5）医源性诱导的抗鼠 Ig (s) 抗体临床开展的用鼠源性 CD3 等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体 内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠 Ig (s) 抗体。这些病人 ELISA 测定时均可产生假阳性。解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠 Ig (s) ，从而克服由于上述原因造成的假阳性。 （6）交叉反应物质 类地高辛、类 AFP 样物质等，是与
26、靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时 ，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。 （7）标本中其它成分的影响 血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对 ELISA 测定结果有干扰作用。 2外源性物质 外源性物质常常是由于用于 ELISA 测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集 不全和采血管中添加物等影响。 （1）标本溶血 由于各种人为原因引起的标本溶血，均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化物酶为标记的 EL
27、ISA 测定中，会导致非特异性显色，干扰测定结果。为克服上述干扰作用，标本采集时必须注意避免溶血。（2）标本受细菌污染 因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。 （3）标本保存不当 在冰箱中保存过久的标本，血清中 IgG 可聚合成多聚体、AFP 可形成二聚体，在间接法 ELISA 测定中会导致本底过深、甚至造成 假阳性；标本放置时间过长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA 测定的血清 标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 天内测定的血清标本可存放于 4，1 周后测定的血清标
28、本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋 白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。 （4）标本凝集不全在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液采集后 1/22h 开始凝固，1824h 完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取 时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在 ELISA 测定过程中可以形成 肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；这类情况于次日复查时因血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白原存在，故复查结果变为阴性 。为避免上述干扰作用，解决的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血 管中加入适当的促凝剂。 （5）标本管中添加物质的影响 抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如 NaN3 可抑制 ELISA 系统中辣根过氧化物酶活性）及快速分离血清的分离胶等均对 E LISA 测定有一定干扰作用。 综上所述，对临床检验 ELISA 测定中出现的假阳性或假阴性结果，在考虑试剂因素和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并应采取相应措施排除干扰作用，从而为临床提供正确可靠的检测结果。
