1、免疫荧光一般步骤固定液配制：常用固定液为 4%多聚甲醛，将 40g 多聚甲醛粉剂在三角烧瓶中溶于 1000ml 0.1M PB 溶液中,放入磁力转子置于加热磁力搅拌器中加热溶解，温度切忌超过 70，温度过高会导致多聚甲醛解聚成为甲醛，遮蔽抗体影响抗原抗体结合，溶解后待其冷却，调节 PH 值至 7.4，过滤后室温或 4放置备用，配好后一个月内有效，最好现配现用。2.5多聚甲醛(含苦味酸 300ml1000ml)亦是选择，由于渗透压的关系 ,缓中液改为 NaH2PO4.H 2O 3.74g；Na 2HPO4.12H2O 45.11g（500ml:1.87g,22.55g）灌注固定：快速生理盐水冲净
2、血液（约需要 100ml 即可） ，4%多聚甲醛灌注（快速充灌 100ml 左右，再慢速滴 150ml） 。灌注用的针头前端要磨平，灌注小鼠可以用较粗的头皮针，仅留 1cm，插入左心室即可，不必像大鼠那样插入主动脉根部。取材按要求不同取组织，取材部位一定要事先确定好，比如脊髓呈现节段性变化，只有取到正确的部位才能获得结果。坐骨神经对应的脊髓阶段（，）在第一腰椎下，第五腰椎下是第五神经节，对应髂前上棘（动物其实不叫这个名）前缘。后固定及蔗糖脱水：组织取材后切成小块放入 4%多聚甲醛中，为后固定，建议 4过夜，随后转入 40%蔗糖溶液中脱水（不沉底） ，3 天后即可用于冰冻切片。后固定时间亦不可过
3、长。脱水不彻底表现为组织切片上空洞样组织破坏；固定不完全表现为微米染色集中在周边，组织内部不着色。蔗糖溶液亦用 0.1M PB 配制（见附录） 。冰冻切片：漂染时，脊髓片厚可以 2530 微米，神经节片厚要 30 微米免疫荧光染色：1. TBS 溶液清洗组织片 5 分钟2，有利于抗原抗体结合（可选）2. 封闭液（10血清+1%BSA）0.3%triton-100 *室温封闭 2 小时，亦可 4过夜，除个别膜抗原外，都需要加 triton-100*;个人习惯的做法是把封闭液分装成 1ml/管，保存在-20 度，用前添加 3 微升 triton-1003. 一抗孵育 4 过夜，一抗浓度需要通过预实
4、验进行确定，比较常见的是。 （一抗稀释液见附录，建议用）4. TBS 溶液清洗组织片 5 分钟35. 二抗孵室温两小时或 4过夜，感觉背景深的话,建议 4过夜。 6. TBS 溶液中置于摇床上清洗组织片 5 分钟37. 暗室内将组织片贴于载玻片上，室温晾干，载玻片最好经甲醛明胶处理过,防止粘不牢脱片。微弱的光线对贴片造成相当的困难，特别是像神经节和小鼠脊髓这样的较小的切片，切片皱折，相互覆盖都会导致无法拍照，我的经验是可以用吸管将切片全部吸到载玻片上，然后尽量吸掉水，也可用毛笔等进一步去掉水份，然后室温晾干，大约一小时左右即可。光线方面也不是特别严格，可以用台灯的反射光进行照明，目前认为只要不
5、是光线直射就可以。8. 90%甘油封片，注意汽泡。90% 提前配好，用一个 20ml 玻璃小瓶或者试管，加入甘油和 PBS（或者 TBS OR 生理盐水）混匀，放置以消去气泡。封片时甘油通常会加多，可以在封片后用卫生纸或者滤纸在边缘吸取多余的甘油，以防止粘到显微载物台上。9. 荧光观察10. 荧光双标与单标程序相同，也可顺序标记，购买带有相应荧光标记的一抗是个好办法。购买抗体后首先是确定抗体的有效性并确定抗体的工作浓度，有效性是通过阳性对照（有蛋白表达的组织标本）来实现，确定抗体的工作浓度要用不同的稀释比例分别染来实现，比如 1：100，1：200，1：500，三个浓度，可以节约抗体，用加有叠
6、氮钠的抗体稀释液（见下）也可回收抗体保存在 4 度，可用 2-3 次；抗体一般要分装保存在-20 度，解冻用不完的抗体可 4 度保存两周；阴性对照也是必须的，即不加一抗只加二抗，特别是染新蛋白的情况下。附：1. Tris 缓冲液配方（0.5M,PH7.6 10）：Tris 60.57g；1N HCL(N 是当量,相当于一元有效物1M，1N 盐酸桐当于 1M 盐酸，而 1N 硫酸相当于 0.5MT 硫酸)约 420ml 双蒸水加至 1000ml 先以少量双蒸水溶解 Tris,加入 HCL 后，调至 7.6，此液为储存液,4 保存。2. TBS 配方:Tris-HCL 缓冲液 100ml 加 Na
7、Cl8.59g 双蒸水加至 1000ml3. 一抗稀释液：15Mm/L NaN3 ,1%BSA,0.01M/LPBS PH7.44. 甲醛明胶: 40%甲醛 2.5 ml ,明胶 0.5 g 蒸馏水至 100 ml,配制方法：用少许蒸馏水（约 80 ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至 100 ml 混匀即可。5. 0.1M PB：Na 2HPO4 12H2O 28.7g,NaH2PO4 2H2O 2.96g,用 1000ml 双蒸水溶解。6. 2.5多聚甲醛(含苦味酸 300ml1000ml) 亦是选择，由于渗透压的关系,缓中液改为NaH2PO4.H 2O 3.74g
8、；Na 2HPO4.12H2O 45.11g（500ml:1.87g,22.55g ）7. 免疫荧光用到的材料：较大剪刀（灌注） ，大号止血钳（灌注） ，中号止血钳（灌注） ，多聚甲醛（灌注）磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、蔗糖、滤纸、三角烧瓶（灌注） ，小鼠灌注需 20ml 注射器两个，头皮针（将头皮针插入左心室即可） ，六孔板（清洗切片） ，染色板（为圆底塑料板，可节约抗体） ，tris 碱，甘油，载玻片，盖玻片，毛笔（大小号） ，triton-100,牛血清白蛋白(BSA), 叠氮钠,血清, 盐酸,枪头,EP 管, 饭盒(遮光用), 眼科剪, 镊子。8. 相关软件:Photoshop、ImagePro(图像分析) 、Sigmaplot(统计作图 )免疫组化的功能是对蛋白进行定性和半定量，定量比较理想的是结合 western blot，不能结合的，需要足够的标本并选取一定量的切片数量 ，一般需三个样本，每个样本 7-8 张切片。 *因 triton-100 是油性的液体，易粘到吸管的外壁上导致加样多于 3 微升，建议吸取 3 微升的液体之后，用纸擦拭然后再进行加样。
