1、齐齐齐 齐 婧 婧婧 婧（Vicky Qi）March, 2011细胞凋亡通路研究工具与全面检测方案细胞凋亡通路研究工具与全面检测方案细胞凋亡通路研究工具与全面检测方案细胞凋亡通路研究工具与全面检测方案细胞凋亡通路研究工具与全面检测方案细胞凋亡通路研究工具与全面检测方案细胞凋亡通路研究工具与全面检测方案细胞凋亡通路研究工具与全面检测方案提提提提 纲 纲纲纲一一一一 . 什么是凋亡什么是凋亡什么是凋亡什么是凋亡 &凋亡的意义凋亡的意义凋亡的意义凋亡的意义二二二二 . 凋亡的两条主要途径凋亡的两条主要途径凋亡的两条主要途径凋亡的两条主要途径 &如何研究凋亡如何研究凋亡如何研究凋亡如何研究凋亡三三三
2、三 . 凋亡作为研究工具凋亡作为研究工具凋亡作为研究工具凋亡作为研究工具 &如何检测凋亡如何检测凋亡如何检测凋亡如何检测凋亡Inhibitor Prof. Signal Transduction什么是细胞凋亡什么是细胞凋亡什么是细胞凋亡什么是细胞凋亡 ？Inhibitor Prof. Signal Transduction细胞坏死细胞坏死细胞坏死细胞坏死细胞死亡细胞死亡细胞死亡细胞死亡凋亡凋亡凋亡凋亡 细胞程序性坏死细胞程序性坏死细胞程序性坏死细胞程序性坏死生如夏花之绚烂生如夏花之绚烂生如夏花之绚烂生如夏花之绚烂 死如秋叶之静美死如秋叶之静美死如秋叶之静美死如秋叶之静美凋亡是种自然现象凋亡是种
3、自然现象凋亡是种自然现象凋亡是种自然现象细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡 （ （ Apoptosis）：）：）：）：细胞在一定的生理及病理条件下细胞在一定的生理及病理条件下细胞在一定的生理及病理条件下细胞在一定的生理及病理条件下 ， ，遵循自身的程序遵循自身的程序遵循自身的程序遵循自身的程序 ， ，自己结束其生命 自己结束其生命自己结束其生命自己结束其生命的过程的过程的过程的过程 ， ，最后细胞裂解为若干凋亡 最后细胞裂解为若干凋亡最后细胞裂解为若干凋亡最后细胞裂解为若干凋亡小体小体小体小体 ， ，被其他细胞吞噬 被其他细胞吞噬被其他细胞吞噬被其他细胞吞噬 。 。现在很多 现在很多现在很多现在
4、很多情况下情况下情况下情况下 ， ，亦称为程序性细胞死亡 亦称为程序性细胞死亡亦称为程序性细胞死亡亦称为程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD） ） 自然性自然性自然性自然性 有序性有序性有序性有序性 有充分时间发生有充分时间发生有充分时间发生有充分时间发生Inhibitor Prof. Signal Transduction凋亡的专业定义凋亡的专业定义凋亡的专业定义凋亡的专业定义凋亡的生理意义凋亡的生理意义凋亡的生理意义凋亡的生理意义1. 确保正常发育确保正常发育确保正常发育确保正常发育 、 、生长 生长生长生长蝌蚪蝌蚪蝌蚪蝌蚪 VS 青蛙青蛙青蛙青蛙 ？ ？
5、鸡爪 鸡爪鸡爪鸡爪 VS 鸭蹼鸭蹼鸭蹼鸭蹼 ？ ？2. 维持内环境稳定维持内环境稳定维持内环境稳定维持内环境稳定80岁的老人岁的老人岁的老人岁的老人 ： ：骨髓多重 骨髓多重骨髓多重骨髓多重 ? 小肠多长小肠多长小肠多长小肠多长 ? 3. 发挥积极的防御功能发挥积极的防御功能发挥积极的防御功能发挥积极的防御功能细胞毒性细胞毒性细胞毒性细胞毒性 T细胞的杀伤作用细胞的杀伤作用细胞的杀伤作用细胞的杀伤作用Inhibitor Prof. Signal Transduction2吨吨吨吨！ ！16千米千米千米千米 ！I型糖尿病型糖尿病型糖尿病型糖尿病神经退行性疾病神经退行性疾病神经退行性疾病神经退行性
6、疾病 ： ：阿尔兹海默 阿尔兹海默阿尔兹海默阿尔兹海默 、 、帕金森氏症帕金森氏症帕金森氏症帕金森氏症 、 、亨廷顿氏症等 亨廷顿氏症等亨廷顿氏症等亨廷顿氏症等动脉粥样硬化动脉粥样硬化动脉粥样硬化动脉粥样硬化艾滋病艾滋病艾滋病艾滋病恶性肿瘤恶性肿瘤恶性肿瘤恶性肿瘤 ： ：乳腺癌 乳腺癌乳腺癌乳腺癌 ， ，前列腺癌 前列腺癌前列腺癌前列腺癌 ， ，白血病白血病白血病白血病自身免疫性疾病自身免疫性疾病自身免疫性疾病自身免疫性疾病 ： ：系统性红斑狼 系统性红斑狼系统性红斑狼系统性红斑狼疮疮疮 疮， ， ，风湿性关节炎 风湿性关节炎风湿性关节炎风湿性关节炎病毒感染病毒感染病毒感染病毒感染太多太多太多
7、太多太少太少太少太少凋亡的病理意义凋亡的病理意义凋亡的病理意义凋亡的病理意义细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡Inhibitor Prof. Signal Transduction1.性质性质性质性质2.诱导因素诱导因素诱导因素诱导因素 强烈刺激强烈刺激强烈刺激强烈刺激 ， ，随机发生 随机发生随机发生随机发生 较弱刺激较弱刺激较弱刺激较弱刺激 ， ，非随机发生 非随机发生非随机发生非随机发生3.生化特点生化特点生化特点生化特点4.形态变化形态变化形态变化形态变化6.DNA5.炎症反应炎症反应炎症反应炎症反应7.凋亡小体凋亡小体凋亡小体凋亡小体8.基因调控基因调控基因调控基因调控被动过程被动过程
8、被动过程被动过程 ， ，无新蛋白合成 无新蛋白合成无新蛋白合成无新蛋白合成 ， ，不耗能不耗能不耗能不耗能细胞结构全面溶解细胞结构全面溶解细胞结构全面溶解细胞结构全面溶解 、 、破坏 破坏破坏破坏 、 、细胞肿胀细胞肿胀细胞肿胀细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整胞膜及细胞器相对完整胞膜及细胞器相对完整胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩细胞皱缩细胞皱缩细胞皱缩 ， ，核固缩 核固缩核固缩核固缩DNA随机降解电泳呈弥散状随机降解电泳呈弥散状随机降解电泳呈弥散状随机降解电泳呈弥散状 DNA片段化片段化片段化片段化 （ （ 180-200bp） ）降解 降解降解降解电泳呈电泳呈电泳呈电泳呈 “梯梯梯 梯 ”状条带
9、状条带状条带状条带溶酶体破裂溶酶体破裂溶酶体破裂溶酶体破裂 ， ，局部炎症反应 局部炎症反应局部炎症反应局部炎症反应 溶酶体相对完整溶酶体相对完整溶酶体相对完整溶酶体相对完整 ， ，无局部炎症反应 无局部炎症反应无局部炎症反应无局部炎症反应有有有 有病理性病理性病理性病理性 ， ，非特异性 非特异性非特异性非特异性 生理性或病理性生理性或病理性生理性或病理性生理性或病理性 ， ，特异性 特异性特异性特异性无无无 无 有 有有 有无无无 无凋亡与坏死的区别凋亡与坏死的区别凋亡与坏死的区别凋亡与坏死的区别Inhibitor Prof. Signal Transduction坏死坏死坏死坏死 凋亡凋
10、亡凋亡凋亡主动过程主动过程主动过程主动过程 ， ，有新蛋白合成 有新蛋白合成有新蛋白合成有新蛋白合成 ， ，耗能耗能耗能耗能Inhibitor Prof. Signal Transduction凋亡细胞与正常细胞凋亡细胞与正常细胞凋亡细胞与正常细胞凋亡细胞与正常细胞 /坏死细胞坏死细胞坏死细胞坏死细胞提提提提 纲 纲纲纲一一一一 . 什么是凋亡什么是凋亡什么是凋亡什么是凋亡 &凋亡的意义凋亡的意义凋亡的意义凋亡的意义二二二二 . 凋亡的两条主要途径凋亡的两条主要途径凋亡的两条主要途径凋亡的两条主要途径 &如何研究凋亡如何研究凋亡如何研究凋亡如何研究凋亡三三三三 . 凋亡作为研究工具凋亡作为研究
11、工具凋亡作为研究工具凋亡作为研究工具 &如何检测凋亡如何检测凋亡如何检测凋亡如何检测凋亡Inhibitor Prof. Signal TransductionInhibitor Prof. Signal Transduction二二二二 . 凋亡作为研究对象凋亡作为研究对象凋亡作为研究对象凋亡作为研究对象Mitochondrial Pathway(Intrinsic Pathway)Death Receptor Pathway(Extrinsic Pathway)FasLCaspase 3DDDDDDFas/Apo1/CD95FADDProcaspase 8Caspase 8Bidoxidan
12、ts ceramide othersBcl-2DCytochrome cdATPProcaspase 9Apaf -1dATPApaf -1Caspase 9Procaspase 3ApoptosomeDNA damageCellular targets凋亡的两条途径凋亡的两条途径凋亡的两条途径凋亡的两条途径Inhibitor Prof. Signal TransductiontBid凋亡外源途径凋亡外源途径凋亡外源途径凋亡外源途径 TNF/TNFR家族家族家族家族head2right TNF超家族超家族超家族超家族 ： ：超过超过超过超过 16个成员个成员个成员个成员 ： ： TNF,TNF
13、, FasL, TRAIL, NGF, CD27L, CD40L, etcII 型跨膜蛋白型跨膜蛋白型跨膜蛋白型跨膜蛋白C末端的胞外区能形成可溶性的三聚体末端的胞外区能形成可溶性的三聚体末端的胞外区能形成可溶性的三聚体末端的胞外区能形成可溶性的三聚体具有膜结合型和可溶型两种形式具有膜结合型和可溶型两种形式具有膜结合型和可溶型两种形式具有膜结合型和可溶型两种形式head2right TNFR超家族超家族超家族超家族 ： ：超过超过超过超过 20个成员个成员个成员个成员 ： ： TNFR1, TNFR2, Fas, DR4(TRAIL R1), DR5(TRAIL R2), DcR1(TRAIL
14、R3), DcR2(TRAIL R4), CD40, etc 型跨膜蛋白 型跨膜蛋白型跨膜蛋白型跨膜蛋白胞内区胞内区胞内区胞内区 “死亡结构域死亡结构域死亡结构域死亡结构域 ”（ （ Death Domain） ）Inhibitor Prof. Signal TransductionFas Ligand ELISA Kit1. 96孔板夹心孔板夹心孔板夹心孔板夹心 ELISA法法法 法， ， ，提供 提供提供提供 FasL标准品标准品标准品标准品2. 灵敏度灵敏度灵敏度灵敏度 0.02ng/mL3. 膜结合膜结合膜结合膜结合 FasL (mFasL)4. 组织培养上清中的可溶性组织培养上清中的
15、可溶性组织培养上清中的可溶性组织培养上清中的可溶性 FasL (sFasL)5. 人血清中的可溶性人血清中的可溶性人血清中的可溶性人血清中的可溶性 FasL (sFasL)TNF/TNFR家族的检测家族的检测家族的检测家族的检测Inhibitor Prof. Signal TransductionTRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand)肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL受体分为两类受体分为两类受体分为两类受体分为两类 ： ： 一类是死亡受体一类是死亡
16、受体一类是死亡受体一类是死亡受体 （ （如 如如 如 DR4和和和 和 DR5），），），）， 主要诱导肿瘤细胞或转主要诱导肿瘤细胞或转主要诱导肿瘤细胞或转主要诱导肿瘤细胞或转化细胞凋亡化细胞凋亡化细胞凋亡化细胞凋亡 ； ； 另一类是 另一类是另一类是另一类是 “诱骗诱骗诱骗诱骗 ”受体受体受体受体 （ （如 如如 如 DcR1和和和 和 DcR2），），），）， 保护正常细胞免遭保护正常细胞免遭保护正常细胞免遭保护正常细胞免遭 TRAIL诱导凋亡诱导凋亡诱导凋亡诱导凋亡 ； ；TRAIL选择性杀伤肿瘤细胞的机制选择性杀伤肿瘤细胞的机制选择性杀伤肿瘤细胞的机制选择性杀伤肿瘤细胞的机制 : TR
17、AIL可诱导多种转化细胞和肿瘤细胞发生凋亡可诱导多种转化细胞和肿瘤细胞发生凋亡可诱导多种转化细胞和肿瘤细胞发生凋亡可诱导多种转化细胞和肿瘤细胞发生凋亡， ，但对大多数正常组织却没有毒性 但对大多数正常组织却没有毒性但对大多数正常组织却没有毒性但对大多数正常组织却没有毒性 。 。这种特性使 这种特性使这种特性使这种特性使 TRAIL成为肿瘤治疗中一种很有前成为肿瘤治疗中一种很有前成为肿瘤治疗中一种很有前成为肿瘤治疗中一种很有前途的药物途的药物途的药物途的药物 。 。TRAIL与肿瘤治疗与肿瘤治疗与肿瘤治疗与肿瘤治疗Inhibitor Prof. Signal TransductionMitoch
18、ondrial Pathway(Intrinsic Pathway)Death Receptor Pathway(Extrinsic Pathway)FasLCaspase 3DDDDDDFas/Apo1/CD95FADDProcaspase 8Caspase 8Bidoxidants ceramide otherstBidBcl-2DCytochrome cdATPProcaspase 9Apaf -1dATPApaf -1Caspase 9Procaspase 3ApoptosomeDNA damageCellular targetsInhibitor Prof. Signal Trans
19、ductionCaspases家族家族家族家族Caspases结构与分类结构与分类结构与分类结构与分类Inhibitor Prof. Signal TransductionCaspase-1 Tyr-Val-Ala-Asp YVADCaspase-2 Val-Asp-Val-Ala-Asp VDVADCaspase-3 Asp-Glu-His-Asp DEVDCaspase-4 Leu-Glu-Val-Asp LEVDCaspase-5 Trp-Glu-His-Asp WEHDCaspase-6 Val-Glu- Ile -Asp VEIDCaspase-7 Val-Asp-Gln-Val-A
20、sp VDQVDCaspase-8 Ile-Glu-Thr-Asp LETDCaspase-9 Leu-Glu-His-Asp LEHDCaspase-13 Leu-Glu-Glu-Asp LEEDCaspases 底物序列底物序列底物序列底物序列Inhibitor Prof. Signal Transduction1 根据根据根据根据 caspase特定的四肽底物位点设计的特定的四肽底物位点设计的特定的四肽底物位点设计的特定的四肽底物位点设计的 ， ，是 是是 是caspasecaspase活性中心的抑制剂活性中心的抑制剂活性中心的抑制剂活性中心的抑制剂 。 。3 C末端连接的化学基团决定了
21、末端连接的化学基团决定了末端连接的化学基团决定了末端连接的化学基团决定了 caspase抑制剂可逆与否抑制剂可逆与否抑制剂可逆与否抑制剂可逆与否 。 。(CHO(CHO、 、FMKFMK、 、CMK)CMK)4 抑制剂的细胞通透性抑制剂的细胞通透性抑制剂的细胞通透性抑制剂的细胞通透性 。 。2 分为选择性的分为选择性的分为选择性的分为选择性的 caspase 抑制剂和泛抑制剂和泛抑制剂和泛抑制剂和泛 caspase 抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂 。 。50多种多种多种多种 caspases抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂Caspases 的研究与检测的研究与检测的研究与检测的研究与检测 抑制剂抑制剂抑制剂
22、抑制剂Inhibitor Prof. Signal Transduction原理原理原理原理 ： ： 在在在 在CaspaseCaspase的底物多肽上标记荧光素或发色团的底物多肽上标记荧光素或发色团的底物多肽上标记荧光素或发色团的底物多肽上标记荧光素或发色团 ， ，当活化的 当活化的当活化的当活化的Caspase剪切标记的底物多肽后剪切标记的底物多肽后剪切标记的底物多肽后剪切标记的底物多肽后 ， ，荧光素 荧光素荧光素荧光素 （ （AFCAFC或或或 或AMCAMC） ）或发色团 或发色团或发色团或发色团(pNA)被释放出来被释放出来被释放出来被释放出来 ， ，引起发光或显色反应 引起发光或
23、显色反应引起发光或显色反应引起发光或显色反应 ， ，其荧光强度或溶液颜 其荧光强度或溶液颜其荧光强度或溶液颜其荧光强度或溶液颜色深浅与色深浅与色深浅与色深浅与 caspase活性成正比活性成正比活性成正比活性成正比 。 。应用应用应用应用 ： ： 检测凋亡细胞的检测凋亡细胞的检测凋亡细胞的检测凋亡细胞的 caspases活性及筛选活性及筛选活性及筛选活性及筛选 caspases的激活剂或的激活剂或的激活剂或的激活剂或抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂 。 。方法方法方法方法 ： ： 直接法直接法直接法直接法 、 、免疫捕获法 免疫捕获法免疫捕获法免疫捕获法 、 、抑制剂结合法 抑制剂结合法抑制剂结合法抑
24、制剂结合法Caspases 活性检测活性检测活性检测活性检测Inhibitor Prof. Signal Transduction基于底物剪切的基于底物剪切的基于底物剪切的基于底物剪切的 Caspase活性检测试活性检测试活性检测试活性检测试剂盒剂盒剂盒剂盒 直接法直接法直接法直接法荧光或比色检测荧光或比色检测荧光或比色检测荧光或比色检测样品样品样品样品 ： ：细胞裂解物或纯化 细胞裂解物或纯化细胞裂解物或纯化细胞裂解物或纯化 、 、半纯化 半纯化半纯化半纯化 caspase适用于适用于适用于适用于 96孔板检测孔板检测孔板检测孔板检测Sample (Enzyme) Add Substrate
25、Fluorescence or ColorInhibitor Prof. Signal TransductionCaspases 活性检测活性检测活性检测活性检测基于底物剪切的基于底物剪切的基于底物剪切的基于底物剪切的 Caspase活性检活性检活性检活性检测试剂盒测试剂盒测试剂盒测试剂盒 免疫捕获法免疫捕获法免疫捕获法免疫捕获法测定板经测定板经测定板经测定板经 caspases抗体包被抗体包被抗体包被抗体包被特异地特异地特异地特异地 捕获样品中捕获样品中捕获样品中捕获样品中 caspases避免底物被样品中其它酶类切割避免底物被样品中其它酶类切割避免底物被样品中其它酶类切割避免底物被样品中其
26、它酶类切割荧光或比色检测荧光或比色检测荧光或比色检测荧光或比色检测Anti-EnzymeAdd SubstrateCapture EnzymeFluorescence or ColorCaspases 活性检测活性检测活性检测活性检测基于抑制剂结合法的基于抑制剂结合法的基于抑制剂结合法的基于抑制剂结合法的 Caspase活性检测活性检测活性检测活性检测用标记荧光素的用标记荧光素的用标记荧光素的用标记荧光素的 caspase 抑制剂处理细胞抑制剂处理细胞抑制剂处理细胞抑制剂处理细胞荧光标记的荧光标记的荧光标记的荧光标记的 caspase 抑制剂不可逆的与凋亡细胞抑制剂不可逆的与凋亡细胞抑制剂不可
27、逆的与凋亡细胞抑制剂不可逆的与凋亡细胞中的活化中的活化中的活化中的活化 caspase 相结合相结合相结合相结合方法方法方法方法 ： ：流式细胞仪 流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪 、 、荧光计或荧光显微镜 荧光计或荧光显微镜荧光计或荧光显微镜荧光计或荧光显微镜能够方便能够方便能够方便能够方便 、 、灵敏地在活细胞中 灵敏地在活细胞中灵敏地在活细胞中灵敏地在活细胞中 原位原位原位原位 （ （ in situ） ） 检检检 检测活化的测活化的测活化的测活化的 caspase+ FITC-VAD-FMKFITC-VAD-FMKInhibitor Prof. Signal TransductionFI
28、TC-VAD-FMKCaspases 活性检测活性检测活性检测活性检测PARP： ： Poly-ADP(ribose) Polymerase 定位于细胞核定位于细胞核定位于细胞核定位于细胞核 参与参与参与参与 DNA损伤修复损伤修复损伤修复损伤修复 负调控核酸内切酶负调控核酸内切酶负调控核酸内切酶负调控核酸内切酶 ， ，失活后导致核酸内切酶活性增强 失活后导致核酸内切酶活性增强失活后导致核酸内切酶活性增强失活后导致核酸内切酶活性增强 ， ，裂解 裂解裂解裂解 DNA 可被活化的可被活化的可被活化的可被活化的 caspase-3裂解为裂解为裂解为裂解为 31kD的的的 的 N-末端末端末端末端
29、DNA结合域和结合域和结合域和结合域和 85kD的的的 的 C-末端催化域末端催化域末端催化域末端催化域 ， ，从 从从 从而不能发挥正常功能而不能发挥正常功能而不能发挥正常功能而不能发挥正常功能 ， ，是凋亡发生的重要事件 是凋亡发生的重要事件是凋亡发生的重要事件是凋亡发生的重要事件512729, PARP Cleavage Detection Kit： ： 裂解细胞 裂解细胞裂解细胞裂解细胞 、 、超声破坏 超声破坏超声破坏超声破坏 PARP/DNA 的相互作用的相互作用的相互作用的相互作用 Western blot 检测检测检测检测 完整完整完整完整 PARP和被切割后的和被切割后的和被
30、切割后的和被切割后的 PARP可检测人可检测人可检测人可检测人 ， ，牛 牛牛 牛， ， ，小鼠 小鼠小鼠小鼠 ， ，大鼠样本 大鼠样本大鼠样本大鼠样本 ； ；提供提供提供提供 PARP标准品和对照封闭短肽标准品和对照封闭短肽标准品和对照封闭短肽标准品和对照封闭短肽 ； ；提供未诱导和诱导凋亡的提供未诱导和诱导凋亡的提供未诱导和诱导凋亡的提供未诱导和诱导凋亡的 HL60细胞抽提物作为对照品细胞抽提物作为对照品细胞抽提物作为对照品细胞抽提物作为对照品 ； ；Inhibitor Prof. Signal TransductionCaspases切割底物的检测切割底物的检测切割底物的检测切割底物的检
31、测目前已发现大于目前已发现大于目前已发现大于目前已发现大于 8种人源的种人源的种人源的种人源的 IAP， ，包括 包括包括包括 c-IAP1， ， c-IAP2， ， NIAP， ， XIAP， ， Survivin等等等 等； ； ；都有都有都有都有 70 80个氨基酸的个氨基酸的个氨基酸的个氨基酸的 BIR（ （ baculoviral IAP repeat ） ）结构域 结构域结构域结构域 ， ，是与其他蛋白 是与其他蛋白是与其他蛋白是与其他蛋白结合的重要部位结合的重要部位结合的重要部位结合的重要部位 ； ；唯一一组既能抑制起始唯一一组既能抑制起始唯一一组既能抑制起始唯一一组既能抑制起始
32、 caspase（ （如 如如 如 caspase-9） ）又能抑制执行 又能抑制执行又能抑制执行又能抑制执行 caspase（ （如 如如 如caspase-3） ）活性的内源性蛋白质 活性的内源性蛋白质活性的内源性蛋白质活性的内源性蛋白质 ； ；和内源性促凋亡因子和内源性促凋亡因子和内源性促凋亡因子和内源性促凋亡因子 ， ，如 如如 如 Smac, Omi/HtrA2, XAF1等相互结合等相互结合等相互结合等相互结合 ， ，使它们进入泛素 使它们进入泛素使它们进入泛素使它们进入泛素降解途径降解途径降解途径降解途径 ， ，从而调控凋亡进程 从而调控凋亡进程从而调控凋亡进程从而调控凋亡进程
33、； ；Caspases内源性抑制剂内源性抑制剂内源性抑制剂内源性抑制剂 IAP家族的检测家族的检测家族的检测家族的检测（ （ 1） ）抗体 抗体抗体抗体 （ （抗 抗抗 抗 XIAP， ， Survivin， ， Livin） ）（ （ 2） ）重组蛋白 重组蛋白重组蛋白重组蛋白 （ （ rhc-IAP-1） ）（ （ 3） ）抑制剂 抑制剂抑制剂抑制剂 /激活剂激活剂激活剂激活剂（ （ 4） ）检测试剂盒 检测试剂盒检测试剂盒检测试剂盒 （ （ CBA049， ， XIAP ELISA Kit） ）Inhibitor Prof. Signal TransductionCa2+ (1 mM 1
34、0-3)Ca2+ (0.1 M 10-7)PTP OpenSmac/DIABLOCytochrome COmi/Htra2Endonuclease GAIFCa2+检测探针检测探针检测探针检测探针 ： ：Indo-1 Fura-2/AMFluo-3/AMInhibitor Prof. Signal TransductionCa2+ (10M 10-5 )凋亡内源途径凋亡内源途径凋亡内源途径凋亡内源途径 线粒体与相关因子线粒体与相关因子线粒体与相关因子线粒体与相关因子Ca2+Bcl-2家族蛋白家族蛋白家族蛋白家族蛋白ROS（ （活性氧 活性氧活性氧活性氧 ） ）神经酰胺神经酰胺神经酰胺神经酰胺线
35、粒体释放因子线粒体释放因子线粒体释放因子线粒体释放因子1. 细胞色素细胞色素细胞色素细胞色素 C （ （ Cytochrome C） ）由两个无活性的前体分子组成由两个无活性的前体分子组成由两个无活性的前体分子组成由两个无活性的前体分子组成 ： ：前细胞色素 前细胞色素前细胞色素前细胞色素 C和亚铁和亚铁和亚铁和亚铁血红素血红素血红素血红素 。 。正常情况下定位于线粒体膜间隙并与内膜 正常情况下定位于线粒体膜间隙并与内膜正常情况下定位于线粒体膜间隙并与内膜正常情况下定位于线粒体膜间隙并与内膜结合结合结合结合 ， ，不能通过外膜 不能通过外膜不能通过外膜不能通过外膜 。 。细胞凋亡过程中 细胞凋
36、亡过程中细胞凋亡过程中细胞凋亡过程中 ， ，从外膜释 从外膜释从外膜释从外膜释放放放 放， ， ，在胞质中与 在胞质中与在胞质中与在胞质中与 Apaf-1及及及 及 procaspase-9结合成为凋结合成为凋结合成为凋结合成为凋亡复合体亡复合体亡复合体亡复合体 （ （ Apoptosome），），），）， 使使使 使 caspase-9激活激活激活激活 。 。2. Smac/DIABLO定位于线粒体定位于线粒体定位于线粒体定位于线粒体 ， ，凋亡信号刺激后与细胞色素 凋亡信号刺激后与细胞色素凋亡信号刺激后与细胞色素凋亡信号刺激后与细胞色素 C一起释放到一起释放到一起释放到一起释放到胞质中胞质
37、中胞质中胞质中 ， ，与多种 与多种与多种与多种 IAP直接结合直接结合直接结合直接结合 ， ，抑制 抑制抑制抑制 IAP的抗凋亡作用的抗凋亡作用的抗凋亡作用的抗凋亡作用 。 。3. AIF（ （ Apoptosis inducing factor） ）定位于线粒体膜间隙定位于线粒体膜间隙定位于线粒体膜间隙定位于线粒体膜间隙 ， ，凋亡诱导释放后 凋亡诱导释放后凋亡诱导释放后凋亡诱导释放后 ， ，直接进入细胞核 直接进入细胞核直接进入细胞核直接进入细胞核并独立作用于染色质并独立作用于染色质并独立作用于染色质并独立作用于染色质 ， ，使得 使得使得使得 DNA呈大片段断裂呈大片段断裂呈大片段断裂
38、呈大片段断裂 （ （ 50kb） ）475866, MitoCapture Apoptosis Detection Kit凋亡早期事件线粒体膜电位下降的检测凋亡早期事件线粒体膜电位下降的检测凋亡早期事件线粒体膜电位下降的检测凋亡早期事件线粒体膜电位下降的检测head2right 原理原理原理原理 ： ：利用阳离子染料对健康细胞和凋亡细胞显示不同荧光 利用阳离子染料对健康细胞和凋亡细胞显示不同荧光利用阳离子染料对健康细胞和凋亡细胞显示不同荧光利用阳离子染料对健康细胞和凋亡细胞显示不同荧光 ， ，来标志 来标志来标志来标志 m 的丧失的丧失的丧失的丧失head2right 健康细胞健康细胞健康细胞
39、健康细胞 : 染料聚集于线粒体染料聚集于线粒体染料聚集于线粒体染料聚集于线粒体 多聚体产生 多聚体产生多聚体产生多聚体产生 明亮明亮明亮明亮 红色荧光红色荧光红色荧光红色荧光head2right 凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞 ： ：由于线粒体转膜电位的变化 由于线粒体转膜电位的变化由于线粒体转膜电位的变化由于线粒体转膜电位的变化 ， ，染料无法聚集于线粒体 染料无法聚集于线粒体染料无法聚集于线粒体染料无法聚集于线粒体 ， ，以单体形 以单体形以单体形以单体形式停留于胞质中式停留于胞质中式停留于胞质中式停留于胞质中 显示显示显示显示 绿色荧光绿色荧光绿色荧光绿色荧光用荧光显微镜用荧光显微镜用
40、荧光显微镜用荧光显微镜 ， ，激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测 激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测每次检测每次检测每次检测每次检测 1 106个细胞个细胞个细胞个细胞 ， ，可供检测 可供检测可供检测可供检测 100次次次 次； ； ；Inhibitor Prof. Signal Transduction线粒体变化的检测线粒体变化的检测线粒体变化的检测线粒体变化的检测Inhibitor Prof. Signal Transduction线粒体变化的检测线粒体变化的检测线粒体变化的检测线粒体变化的检测Cat# QIA87, Cytoc
41、hrome c Release Apoptosis Assay KitCat# CBA077, InnocyteTM Flow Cytometric Cytochrome c Release KitCat# QIA74, Cytochrome c ELISA KitCat# 1029, anti-Cytochrome c (clone 7H8.2C12)Cat# 1030, anti-Cytochrome c (clone 6H2.B4)Mitochondrial Pathway(Intrinsic Pathway)Death Receptor Pathway(Extrinsic Pathway)FasLCaspase 3DDDDDDFas/Apo1/CD95FADDProcaspase 8Caspase 8Bidoxidants ceramide othersBcl-2DCytochrome cdATPProcaspase 9Apaf -1dATPApaf -1Caspase 9Procaspase 3ApoptosomeDNA damageCellular targetsInhibitor Prof. Signal Transduction线粒体的调节因子线粒体的调节因子线粒体的调节因子线粒体的调节因子 Bcl-2家族家族家族家族tBid
