1、第二章 细胞生物学研究方法一、填空题1. 透射电子显微镜由_、_、_三部分所组成。2在酵母人工染色体制备过程中，要用酶脱去酵母的细胞壁，使之成为_，并且用_进行观察和计数。3凝胶过滤层析又称_或_，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的_进行分离和纯化。4观察贴壁生长的培养动物细胞可用_，而观察脱去细胞壁的植物细胞，则要用_。5. 物质在紫外光照射下发出的荧光可分为_和_两种，其中_需要将被照射的物质进行染色.6. 用紫外光为光源观察物体比用可见光的分辨率要高，这是因为_.7 通过_或_形成的细胞叫细胞株.8细菌细胞、酵母菌细胞和植物细胞的细胞壁的化学组成是不同的，所以在制备原生质体时用不同
2、的酶脱壁。一般说来，细菌可用_，酵母可用_ ，9灭活的仙台病毒之所以能够诱导细胞融合，是因为_。10相差显微镜与普通显微镜的区别是用_替代可变光阑，用_代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。11. 倒置显微镜与普通显微镜的不同在于其_ 。12. 若用紫外光为光源，光学显微镜的最大分辨率为_，透射电子显微镜的最大分辨率为_能力，扫描电镜的分辨率为_.13. 显微镜的分辨本领是指能够_能力，用_来表示.14. 高压电镜的电压在 120KV 以上，优点是:_、_.15. 酶细胞化学反应包括两个步骤:_; _.16. 细胞培养的突出特点是: 可在_.17. 用蛋白水解酶消化细胞间的结合物，或用金属离
3、子鳌合剂， 如 EGTA 除去细胞相互黏着所依赖的_， 分离细胞.18贴壁生长的细胞具有三个特点：_；_；_.19. 用细胞培养法来研究生命活动规律的局限性是_.20. 超薄切片染色常采用_和_双染法。21.免疫细胞化学技术是用来定位细胞中的_物质。22. 电子显微镜使用的是_透镜，而光学显微镜使用的是_透镜。23. 电子染色是用_来增强电子的散射能力。24. 在光学显微镜下见到的结构称为_，在电子显微镜下见到的结构称为_。25. 细菌质膜的多功能性主要表现在：具有_的呼吸作用，具有_的分泌作用，具有_的信号传导作用。26. 显微镜的分辨率约等于光波长的_，通常把这一数值看成是光学显微镜分辨力
4、的_。27. 在同位素追踪技术中 ， 用于研究 DNA 的同位素标记的前体物是_.28. 单克隆抗体技术是将_ _与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的术。29可用_ 技术来研究质膜结构的不对称性。30乙醇沉淀 DNA 的主要原理是_ 。31动物细胞培养所用的合成培养基中除含多种_、_和_外一般还需加入_ 。32 用荧光显微镜观察细胞时，经吖啶橙染色的细胞中的 DNA 发_荧光，而 RNA 发_荧光。33. 适于观察活细胞的光学显微镜有_、_和_等。34. 分辨率是指人的肉眼或显微镜在 25cm 处能够分辨到的相邻两个物体间最近距离的能力。人眼为_，普通光学显微镜为_，透射电子显微镜为_，扫描隧道显微镜为
5、_，扫描电子显微镜为_，以紫外光为光源的光学显微镜为_.35细胞内不同组分分级分离的常用方法有离心法、层析法、电泳法等。离心技术可将细胞 匀浆中的不同细胞器或生物大分子进行有效分离。因为不同形态、大小和密度的细胞器 以及不同分子质量的生物大分子在离心力作用下_各不相同。离心分离法又分_和_两种。_离心是一种较为简便的分离法，常用于细胞核和_ 的分离。因为在密度均一的介质中，颗粒越大沉降越_ ，反之则沉降较_ 。这种离心方法只能将那些大小有显著差异的组分分开，而且所获得的分离组分往往不是很纯。而_离心则是较为精细的分离手段，这种离心方法的关键是先在离心管中制备出_或_等介质的浓度梯度并将细胞匀浆
6、装在最上层。在此条件下离心，细胞不同组分将以不同速率沉降并形成不同的沉降带。呈密度梯度的介质可以稳定沉淀成分、防止对流混合。层析法是分离蛋白质的常用手段，其基本原理是不同的蛋白质分子其_和所带_不同，当它们通过某种介质(基质)而与其发生相互作用时，会被不同程度地 _，这样便使不同类型的蛋白质分子移动的快慢不同，从而得以分离。根据蛋白质的大小、所带电荷或特殊的化学集团选择不同的基质的层析，如凝胶过滤柱层析、离子交换树脂柱层析或亲和层析等，可以更有效地分离不同的蛋白质。_法是分离蛋白质、核酸的有效方法，在细胞生物学研究领域有着广泛的应用。其基本原理是，不同种类的蛋白质或核酸所携净电荷的_不同，它们
7、在一定强度的电场中会按所带_、分子的_ 以不同速度在电场中移动，从而得以分离成不同的_.二、判断题1. 透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差或倒置显微镜可以用于观察活细胞。2. 扫描隧道显微镜是具有原子显像力的显微镜。3在等密度梯度离心中蔗糖或甘油的梯度的作用与移动区带离心中梯度原理是不同的，移 动区带离心中梯度的惟一目的是减少样品的扩散，即使是在离心管的底部，颗粒的密也比介质大。相反，在等密度梯度离心中，使用的密度是足以阻止颗粒移动的密度，当颗粒达到与本身密度相同的密度区时就会停留在该区域。4以蔗糖为介质的密度梯度离心又叫差速密度梯度离心。5CsCl 密度梯度离心又称等密度梯度离心
8、。6CsCl 密度梯度离心法分离纯化样品时，样品要和 CsC1 混匀后分装。离心时，样品中不同组分因重力的不同而停留在不同区带。7. 提高显微镜的分辨率，可通过缩短波长，或给标本染色。8. 在光学显微镜下观察到的细胞结构称为亚显微结构，在电子显微镜下观察到的结构称微结构。9为了使光学显微镜或电子显微镜标本的反差增大，可用化学染料对标本进行染色。10亲和层析法按分子内在电荷分离分子。11. 贴壁生长的细胞呈单层生长， 且有接触抑制现象12. 癌细胞的培养，也是单层生长，但没有接触抑制现象13. 生物样品的电镜分辨率是超薄切片厚度的 1/10， 因而切得越薄，照片中反差也越强。14. 用 Trit
9、on 等去垢剂可以抽提细胞中的微管、微丝等蛋白质结构15. 淋巴细胞在体外培养时以贴壁的方式进行生长16. 相差显微镜可用来观察活细胞和未经染色的标本17. 细胞均浆离心时，较小的细胞受较小的摩擦，因而比更大的细胞器更快沉淀。三、选择题 1. 通过选择法或克隆形式从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的细胞群称( )A细胞系 D细胞株 C细胞库 D其他2. 观察活细胞的显微结构时，最好用( )。A. 久荧光显微镜 B相差显微镜 C扫描电镜 D透射电镜3研究 DNA 在细胞中的代谢，常用的同位素标记物有( )。A 14C_戊糖 B 32p_磷酸 C 15N_鸟嘌呤 D 3H-胸腺嘧啶4在
10、细胞培养的研究中，已知细胞培养液与未知细胞培养液的主要区别是( )。A未知培养液是细胞培养研究中最近才发展起来的技术B未知培养液完全是人工制造的C已知培养液包括血清、淋巴因子和其他来自生物体的流质体D已知培养液不含血清、淋巴因子和其他来自生物体的流质体5使用氯化铯密度梯度离心法，其目的是( )。A通过密度梯度来维持重力的稳定性，防止物质对流B用来分离生物分子和细胞亚显微结构C防止生物大分子凝聚沉淀D以上都不对6在凝胶电泳中，示踪染料的移动速度( )。A比各种不同分子样品移动得慢 B与各种不同分子样品移动速度相同C比各种不同分子样品移动得快 D以上都不对 7细胞融合是一个复杂的过程，在此过程中(
11、 )。APEG 可以诱导融合 B用活的仙台病毒可以促融合C不会形成异核体 D只有同类细胞才能融合8. 提高一般光学显微镜的分辨能力，常用的方法有( )A. 利用高折射率的介质(如甘油) B 调节聚光镜， 加红色滤光片C用荧光抗体示踪 D将标本染色91 埃(A)等于 ( )。A10 -4m，10 -1nm，10 -7mm B10 -2m，10 -2nm， 10-2mmC10 -9m，10 -4nm，10 -9mm D10 -5m，10 -6nm， 10-10mm10下列关于杂交瘤技术的描述中，最正确的一项是( )。AB 淋巴细胞与 B 淋巴瘤细胞融合，目的是抑制瘤细胞无限生长B在培养基中加入氨基
12、蝶呤可选出杂交细胞C氨基蝶呤可抑制瘤细胞的蛋白质合成D氨基蝶呤能导致 B 淋巴细胞无限分裂11如果你想要在细胞内部寻找一个含高浓度 Ca2 的区域，下列哪一种显微技术可以选择?A荧光显微技术 B偏光显微技术C相差显微技术 D透射电镜显微技术12细胞融合的诱导剂主要有( )。APEG(聚乙二醇) BTMV(烟草花叶病毒)C亚硝酸 DPHV(植物凝集素)13. 流式细胞仪或流式细胞分选仪能快速测定细胞的下列哪些参数?ADNA 含量 BRNA 含量 巴蛋白质含量 D细胞体积 14在包埋去包埋超薄切片电镜技术中，( )不正确。A不用重金属染色 B分辨率高C没有包埋剂存在 D要用 Triton 去包埋1
13、5. 下列最不可能成为原代细胞培养的细胞来源是( )。A胚胎组织 B活跃生长的恶性肿瘤组织C成年鼠脑组织 D植物原生质体16. 单个植物细胞在体外经过诱导并培养成为完整小植株的实验证明了(A细胞是构成有机体的基本单位 B一切有机体均来自于细胞C细胞是有机体生长发育的基础 D细胞具有遗传的全能性17 光学显微镜有一个放大率为 40 的物镜和放大倍数为 10 的目镜，成像的总放大倍数是( )。A40 B50 C400 D45018下列哪项与显微镜能达到的分辨率无关?A光波波长 B，物镜的放大倍数C标本和透镜之间的物质的折射率 D透镜的数值孔径19. 基因枪是( ) A. 一种将 DNA 包被片大入
14、细胞的枪B用“闪电速度”的酶来合成重组 DNA 的新技术C一种利用重组剿 51A 技术制造的用于战争的大杀伤性武器D以上都不对20为什么聚合酶链式反应要求用从嗜热性细菌中提取的热稳定性 DNA 聚合酶?A只有这种热稳定形式才能辨认四种脱氧核苷酸B这种酶能在一个合理的时间内扩增 DNAC.实际上这种酶是最易得到的一种圆 XIA 聚合酶D只有这种酶才能具有足够的稳定性来耐受 DNA 变性解链所要求的高温21. 核酸杂交可被用来衡量不同物种间进化的亲缘关系，有关相关物种 DNA，下列表述正确的是( )。A较近亲缘关系的物种在较低的解链温度下形成杂交 DNAB较近亲缘关系的物种在较高的解链温度下形成杂
15、交 DNAC在 DNA 杂交解链温度与物种间的亲缘关系之间无相关性D在较近亲缘关系的物种的 DNA 之间无法形成 DNA 杂交分子22利用不同性质的有机染料可对细胞中不同成分进行选择性染色，下列哪种结果有误?A碘液可使口腔上皮细胞的细胞质和细胞核呈深浅不同的棕黄色B吉姆萨染液可使细胞核或染色体呈紫红色或橘红色C甲基绿可使 RNA 分子呈蓝绿色D派洛宁可使 RNA 分子呈红色23在下列哪种情况下，物体在显微镜下的能见性最差?A物体与介质有同样的折射B物体和背景屈光不同C物体衍射了部分但非全部的射在它上面的光线D物体吸收了部分但非全部的射在它上面的光线24关于 X 射线衍射技术，下列哪项有误 ?A
16、是测定生物大分子结构的一项适用技术B可测定蛋白质结晶分子中原子的空间排布CX 射线是波长较短的电磁辐射，比电子的穿透力强D该技术能检测较薄的含水标本25关于共聚焦激光扫描显微镜，下列哪项叙述有误?A以单色激光作为光源B激光变成点光源后聚焦到标本成为点照明C.图像信息要经电脑三维重建处理D所用标本须经超薄切片27现有匀浆的和已经过各级离心的鼠肝细胞溶液，下列哪一组分含有的线粒体最少?A.进行离心之前的整个匀浆溶液B第一次低速离心后的上清液C；经过高速超速离心后的上清液D以上的任何组分都没有线粒体28哪一种柱层析分离蛋白质是建立在分子质量基础上的?A.离子交换层析 B凝胶过滤层析C亲和层析 D等电
17、聚焦29. 为什么透射电镜的照片没有颜色?A细胞内部结构无颜色，都为灰白色的暗影B彩色显微照片太昂贵了C彩色胶片尚未发明D照相的底片接受的是穿过样品的电子，而不是决定了颜色的各种波长的光30在电镜下面发现了一种新的细胞器，但却不能肯定是真的还是技术问题造成的人为现象下列哪一项可证实推测?A在若干个相同来源的相同制备样品中找这一结构B在若干个不同来源的相同制备样品中找这一结构C在不同染色方法制备的样品中找相同结构D在不同的(或无)固定剂条件下制备的样品中找相同结构31氚的半衰期为 12 年，那么保存了 24 年的氚的放射性是最初的( )。A12 B25 C75 D已不存在32. 光镜与电镜比较，
18、下列各项中( )是不正确的。A.电镜用的是电子束，而不是可见光B电镜样品要在真空中观察，而不是暴露在空气中C电镜和光镜的样品都需要用化学染料染色D用于电镜的标本要彻底脱水，光镜则不必33在递增细胞匀浆液的离心转速过程中最先沉淀下来的是( )。 A 核糖体 B线粒体C未破碎的细胞核 D微体34，为了解某一细胞培养物是否处于 DNA 合成时期，在具有放射性胸苷存在的情况下培养细胞，下列哪种方法是探测该标记脱氧核苷酸是否存在于核 DNA 中的最佳方法? ( )。A放射自显影 B聚丙烯酰胺凝胶电泳C.琼脂糖凝胶电泳 D双向凝胶电泳35. 般光学显微镜(用蓝色滤光片 )，当物镜镜口率(NA)为 1.4
19、时，其分辨率极限和放大倍数分别为( )。 A04m，500 倍 B02m ，1000 倍C02m，500 倍 D04m ，1000 倍36. 提高显微镜的分辨率最好的办法是( )。A增加放大倍数 B缩短波长C.增加波长 D给标本染色37. 人胚肺成纤维细胞体外培养大约能传代( )。A20 次左右 B150 次左右C4060 次 D无数次38在细胞分级抽提方法中，为了溶解膜系统，应选用( )。ATritonX-100 BTween 40C.脱氧胆酸钠 D025molL 硫酸钠39假设你对重建生活细胞的有丝分裂过程中染色体的三维形态感兴趣， 你将选择哪种显微技术?A冰冻断裂显微术 B共聚焦扫描术C
20、光学显微术 D扫描电子显微术40下列关于基因敲除实验的表述中，不正确的一项是( )。A需要胚性干细胞作为转化受体 B需要体外构建重组体 C敲除后，靶基因不再存在D一般说来，要经多次传代才能表现出敲除基因的缺陷表型41在 Southern 印迹法中应用的 DNA 片段和 DNA 探针相当于 Northern 印迹法中的( )A. DNA 片段和 RNA 探针 BRNA 片段和 RNA 探针CRNA 片段和 DNA 探针 D蛋白质片段和 DNA 探针42. 在动物细胞培养过程中要用( )来进行观察。 A相差显微镜 B荧光显微镜C倒置显微镜 D普通光学显微镜43关于放射自显影技术，下列哪项错误?A利
21、用放射性同位素探测细胞内生物大分子动态变化的一种方法B包括宏观自显影、光镜自显影和电镜自显影等三种类型C具有灵敏度高和操作简便、无污染等优点D自显影时常用的感光材料，包括 X 射线胶片和原子核乳胶等44. 人眼的分辨率为 105nm，光学显微镜的分辨力能使人眼的分辨力提高( )A. 100 倍 B.500 倍 C1000 倍 D5000 倍四、简答题1简述冰冻蚀刻术的原理和方法。2单克隆抗体技术的基本原理是什么?3电子显微镜为何不能观察活标本?4比较放大率和分辨率。5比较透射电子显微镜和扫描电子显微镜。6，用细菌质粒和噬菌体基因组克隆真核生物的 DNA 有什么不同?7比较差速离心和密度梯度离心
22、。8克隆基因组 DNA 与克隆 cDNA 的区别。五、实验设计与分析1在进行细胞组分的分离时，实验方案设计的一般原则是什么?2匀浆肝组织并且按图 Q21 所示离心分离了亚细胞组分。每一部分保留了小的等分试样(1)对每一等分试样进行琥珀酸脱氢酶(SDH)的专一性酶分析，SDH 是 TCA 循环中的一个酶。假如细胞分离得很完全，哪一部分将被检出有 SDH 活性呢?(2)哪一部分会有最高的 SDH 专一活性(单位蛋白质活性)? (3)哪一部分有最多量的总蛋白质? 图 Q2-1 速度离心分离细胞组分示意(4)分离到最后时，核糖体存在于哪一部分?3凝胶过滤层析依据分子大小来分离不同分子。在溶液中小分子扩
23、散快于大分子，而小分子通过层析柱却比大分子慢，为什么?若以特别快的流速过柱，将会出现什么情况?4用 Sanger 双脱氧核苷法测定一段短的核酸序列(8 个核苷酸)。当 4 支试管中的所有片段都已被分离出来并用放射自显影法显示出来以后，可见图 Q22 的模式。此片段的核苷酸序列是怎样的?哪一端是 5，端，哪一端是 3，端?图 Q2-2 一个 8 核苷酸序列测序电泳图(引自 Pruitt，1996)5解决下列问题可分别采取何种技术?(1)证明在犯罪现场找到的头发中的 DNA 与被告犯罪嫌疑人的 DNA 是吻合的；(2)鉴定分泌到细胞外的糖蛋白激素，其糖基是在细胞的哪一部分被加上去的；(3)寻找新的
24、、便宜的而且丰富的人类生长激素来源，以便用于治疗生长激素缺乏症患者；(4)确定酶蛋白中关键氨基酸的方法。6如何进行差速离心?7用什么方法追踪活细胞中蛋白质合成与分泌过程?包括哪几个步骤?8传统遗传学解决细胞生物学问题的方法是采用跟随信息由基因传到蛋白质的途径。生物化学的方法则是由蛋白质追踪回编码它们的 DNA，例如，从蛋白质到基因。假如你正在研究一个有关细胞功能的问题，如果从基因开始，并试图推断该蛋白质的功能，简单描述可采取的基本步骤。再描述从一种特定的蛋白质开始，最终获得经过测序的该蛋白质基因所要采取的步骤。六、问答题1. 何谓原代培养、细胞株和细胞系?1. 说明电子显微镜和光学显微镜的主要
25、差别。3扫描隧道显微镜的工作原理及其优越性是什么?4用一个镜口角为 70(=70 0)的显微镜研究亚细胞结构：(1)计算显微镜的分辨率，选择空气中的白色光。(2)现在在光源和标本之间放置一块蓝色滤镜。蓝光的波长为 450nm。这样能提高分辨率吗?如果可以的话，能提高多少?(3) 用油镜(折射率：1 5)，仍然使用蓝色滤镜。现在分辨率是多少?如果有设备的话能提高此分辨率的水平吗? 5. 离子交换层析的原理是什么?6. 讨论并比较电子显微镜与光学显微镜的优点及缺点。 7. 动物体细胞克隆有什么意义? 七 .名词释义1 显微分辨率(microscopic resolution) 2. 电子显微术(e
26、lectron microscopy)3 放射自显影技术(autoradiography)4 细胞培养(cell culture)5 双向凝胶电泳(two-dimensional gelelectrophoresis)6 核酸杂交(nucleic acid hybridization)7 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)8 研究人类疾病的动物模型(animal model for human disease)9 荧光显微镜：(fluorescence microscope)10 倒置显微镜(inverted microscope)11 扫描电子显
27、微镜(scanning electron microscope ，SEM)12 显微结构(microscopic structure)13 超微结构(supper-microscopic structure)14 共聚焦显微镜(confocal microscope)15 核磁共振 (nuclear magnetic resonance，NMR）第二章 细胞生物学的研究方法一、填空题1镜筒，真空系统，电力系统2原生质体，相差显微镜3排阻层析，分子筛法，相对分子质量4倒置显微镜，相差显微镜5自发荧光，诱发荧光，诱发荧光6紫外光波长比可见光的波长短7突变，克隆化8溶菌酶，裂解酶，果胶酶或纤维素酶9
28、病毒的外壳成分与细胞膜极为相似10环状光阑，带相板的物镜11物镜和照明系统的位置颠倒120.1m，0 1nm，3 nm13分辨出相邻两个点的，最小分辨距离14穿透性强，不需切片15酶反应，捕捉反应16离体条件下观察和研究生命活动的规律17Ca2+18单层生长，形态变成多态性，具有接触抑制现象19体外环境不能与体内的条件完全等同20柠檬酸铅，醋酸双氧铀21抗原22电磁，玻璃23重金属24显微结构，超微结构25线粒体，高尔基体，质膜26一半，最大值27 3H-胸腺嘧啶核苷28可以产生抗体的淋巴细胞29冰冻蚀刻30脱去与 DNA 分子结合的水31氨基酸，维生素，无机盐，小牛血清32绿色，红色33相差
29、显微镜，暗视野显微镜，倒置显微镜34100 m，02 m，01 nm，0001 nm，3 nm ， 0.1m35沉降速度，差速离心，密度梯度离心，差速，细胞器，快，慢，密度梯度，蔗糖，氯化铯，大小，电荷，滞留或吸附，电泳，性质(正与负) 或多少，净电荷，大小和形状，电泳带谱 .二、判断题1正确。2正确。3正确。4正确。5正确。6错误。因密度不同而停留在不同的区带。7错误。通过染色是不行的。8错误。前者称为显微结构，后者称为亚显微结构或超微结构。9错误。光学显微镜可以，电子显微镜则不可以。10错误。亲和层析能分开特定的大分子是因为它们与特定的配体相互作用，而不是因为它们带有电荷。11正确。 12
30、错误。癌细胞由于失去了接触抑制，因而可成堆生长。13错误。主要是切得越薄，越易穿透。14错误，用 Triton 是不行的，Triton 一般用来分离膜蛋白。15错误。淋巴细胞呈悬浮生长。16正确。17错误。尽管较大的细胞器在流体中移动时来自流体的摩擦力也较大，它经受的离心力也就越大，因此沉降得就越快。三、选择题l.B 2.B 3.D 4.D 5.A 6.C 7.A 8.A 9.A 10.B11.A 12.A 13.ABC 14.D 15. C 16. D 17.C 18.B 19.A 20.D21.B 22.C 23.A 24.D 25.D 26.B 27.C 28.B 29.D 30.D31
31、.B 32.C 33.C 34.A 35.C 36.B 37.C 38.A 39.B 40.C41.C 42.C 43.C 44.B四、简答题1. 先将生物样品在液氮中迅速冷冻，防止形成冰晶，并迅速抽真空。在真空条件下，冰刀横切样品，使样品裂开暴露内表面结构，如细胞膜可沿脂双层分开形成两个半层膜。冰冻蚀 刻技术就是在此基础上发展起来的复形技术。将冰冻断裂后样品表面的冰升华，浮现出样品表面的超微结构，再对浮雕表面进行碳铂复形，随后消化生物材料，只留下复形用作观察。 2B 淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能无限分裂；而瘤细胞不能产生抗体，但能在体外无限传代。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两
32、种亲本细胞的特性，既能产生抗 体，又能无限增殖。3因为电镜样品的观察室要求高度的真空条件。4这两个概念都用于衡量显微镜的显微本领。放大率指显微镜所成像的大小与标本实际大小的比率。而分辨率指可视为明显实体的两个点间的最小距离。放大率对分辨率有影响，但分辨率不仅仅取决于放大率。两者都是观察亚细胞结构的必要参数。5都用于放大与分辨微小结构，这两种电镜通过标本对电子束的影响来探测标本结构。TEM (透射电镜)的电子束穿过标本，聚焦成像于屏幕或显像屏上，SEM(扫描电镜) 的电子束在标本表面进行扫描，反射的电子聚焦成像于屏幕或显像屏。TEM 用于研究超薄切片标本，有极高分辨率，可给出细微的胞内结构。SE
33、M 可以反映未切片标本的表面特征。6都是扩增和储存真核生物 DNA 片段的技术。当克隆的 DNA 数目为几十到几百个碱基对时，细菌质粒是较合适的载体。对于较长的 DNA 分子，病毒载体更合适。在长满菌苔的 平板上可聚集成百上千的噬菌斑，每个都可以用于筛选目的基因。7；两者都是依靠离心力对细胞匀浆悬浮物中的颗粒进行分离的技术。差速离心通常用于分离细胞器与较大的细胞碎片，分离的对象都比介质密度大。密度梯度离心也可用于分离较大的颗粒和细胞器，但更常用来分离小颗粒和大分子物质。密度梯度离心的介质形成一个密度梯度，所分离的颗粒密度小于介质底部的密度。因此颗粒从梯度的顶层沉降到与其密度相同的介质层并停留在
34、此处。8这两种克隆可用于扩增和分离目的基因。基因组 DNA 包含了调控序列和间隔序列，而 c-DNA克隆只含有编码序列。纯 cDNA 便于基因测序和蛋白质氨基酸序列的测定。基因组 DNA 克隆提供了有关 DNA 进化、基因家族和基因调控机制的信息。五、实验设计与分析1根据不同的细胞器或分子具有不同的体积与密度，通过离心力场的作用加以分离。根据这两个主要因素可设计不同的离心分离方法：速度离心、等密度离心等。2(1)总匀浆物，上清 1，沉淀 2；(2)沉淀 2；(3)总匀浆物；(4)上清 3。3在通过凝胶层析柱时，小的分子移动较慢是由于小的分子在到达柱内装填的多孔小球时，在足够的时间内可扩散到凝胶
35、孔隙内部，比大分子要经过更多的空间。如果流速很快，所有的分子都将快速地从小珠间隙中移动，而不进入内部，因此大分子和小分子倾向于一起从柱中流出。 4测序结果如图 A2-1 所示。5(1)进行 PCR 反应后用限制性内切核酸酶处理，经过凝胶电泳，进行限制性长度多态性 检测；(2)用放射性标记糖类示踪，结合放射自显影；(3)分离生长激素基因，重组并克隆，然后从表达该激素的转基因细胞中纯化该激素；(4)定点突变，然后进行酶促动力学分析。6其基本过程是先将细胞用研磨、超声振荡等物理方法破碎，使细胞悬浮液变成包含有细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网小泡等不同大小、形态的细胞器的匀浆液。再将匀浆液放入
36、超迷离心机中离心，由于在密度均一的介质中，不同形态大小细胞器的沉降速度不同，颗粒越大的沉降越快而先到达离心管底。故以不同的离心速度分别离心一定时间，在不同离心力的作用下，细胞内的组分便会按从大到小的顺序分别沉降到离心管底而得以分离。7追踪活细胞中某种蛋白质合成与分泌的过程一般采用同位素示踪技术。其基本步骤是： (1)将放射性同位素标记的氨基酸( 如常用的 3H_亮氨酸) 加到细胞培养基中，在很短时间内使这些与未标记的相应氨基酸化学性质相同的标记分子进入细胞(称作脉冲标记) ；(2)除去培养液并洗涤细胞，再换以含未标记氨基酸的培养基培养细胞，已进入细胞的标 记氨基酸将被蛋白质合成系统作为原料加以
37、利用，掺入到某种新合成的蛋白质中；(3)每隔一定时间取出一定数量的细胞( 取样)，利用电镜放射自显影技术探查被标记的特定蛋白质在不同时间所处的位置。具体说，将每次取样所得的细胞经固定、包埋后制备成细胞的超薄切片，放到有支持膜的载网上，涂上核乳胶，放到暗处曝光一段时间，即让细胞内带有放射性同位素的蛋白质发出的射线使乳胶感光。然后将核乳胶显影、定影便得到电镜显微放射自显影的标本。在电镜下观察该标本中银粒的分布、相关蛋白质在细胞中的位置以及数量的多少。通过比较不同时间取样细胞的电镜照片就可了解细胞中蛋白质合成及分泌的动态过程。8从基因到蛋白质：(1)基因组 DNA 分离目的基因；(2)以基因组 DN
38、A 克隆为探针筛选 mRNA； (3)用目的基因的 mRNA 合成 cDNA；(4)对 cDNA 测序，根据其序列推导出蛋白质的氨基酸序列；(5)与其他功能已知的蛋白质进行氨基酸序列比较；(6)构建含有该基因的质粒载体在大肠杆菌中进行基因表达，或采用其他表达载体，从虽臼质到基因：(1)根据其分子质量、等电点或功能分离蛋白质；(2)对蛋白质进行部分氨基酸测序；(3)推导出编码蛋白质基因的部分核酸序列；(4)合成段放射标记的寡聚核苷链作为探针，在基因组 DNA 中进行筛选；(5)分离出完整的基因，测定包括调控区在内的基因序列。六问答题1.原代培养是直接从机体中取得细胞或组织后立即进行的培养，严格的
39、说是指成功继代之前的培养，此时细胞保持原有的基本性质。通常把第代到第代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养物首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于培养细胞物中的细胞世系所组成。如果不能连续培养或继代次数有限，就称为有限细胞系，如可以连续培养则称为连续细胞系，培养至代以上并无限培养下去。细胞株是指从一个经过生物学鉴定的细胞系，由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群。所以细胞株是通过选择法或克隆形成从原代培养物或细胞系获得的，具有特殊性质或标记的培养细胞可培养至 4050 代。2电子显微镜是以电子束为照明源，通过电子流对样品的透射或反射及电磁透镜的多级放大后在荧光屏上成像
40、的大型仪器，而光学显微镜则是利用可见光照明，将微小物体形成放大影像的光学仪器。概括起来，电镜与光镜主要有以下几个方面的不同： (1)照明源不同。电镜所用的照明源是电子枪发出的电子流，而光镜的照明源是可见光， 由于电子流的波长远短于光波波长，电镜的放大及分辨率显著高于光镜。 (2)透镜不同。电镜中起放大作用的物镜是电磁透镜，而光镜的物镜则是玻璃磨制而成的光学透镜。电镜中的电磁透镜共有三组，分别与光镜中聚光镜、物镜和目镜的功能。 (3)成像原理不同。在电镜中，作用于被检样品的电子束经电磁透镜放大后反映到荧光屏上成像或作用于感光胶片成像。其电子浓淡差别产生的机理是，电子束作用于被检样品时，入射电子与
41、物质的原子发生碰撞产生散射，由于样品不同部位对电子有不同散射度。而光镜中样品的物像以亮度差呈现，它是由被检样品的不同结构吸收光线多少 (4)所用标本制备方式不同。电镜观察所用组织细胞标本的制备程序较复杂，技术难度和费用都较高，在取材、固定、脱水和包埋等环节上需要特殊的试剂和操作，还要制备超薄切片(50100nm)。而光镜观察的标本则一般置于载玻片上，如普通组织切片标本、细胞涂片标本、组织压片标本和细胞滴片标本等。3扫描隧道显微镜(STM)是根据量子力学中的隧道效应发明的。利用扫描探针( 直径为 1 埃)在样品表面扫描。当两者距离达到人数量级时，电子云发生重叠，外加微小电压(mV 级) 针尖与样
42、品间就可因为隧道效应产生隧道电流，这种电流对于针尖与样品的间距 变化特别敏感。如果控制针尖与样品间距，以及保持隧道电流的稳定，那么探针在垂直样品方向上的高低变化，就可反映样品表面的起伏状态，获得样品表面的原子排列图像。STM 适用于表面结构分析、表面电子态和化学特性分析。优越性：(1)高分辨率：原子级分辨率，横向为 1 埃，纵向为 0 1 埃；(2)可直接绘出三维立体结构图像；(3)STM 可在常压、空气甚至溶液中探测样品，且避免了高能电子束的破坏作用；(4)扫描速度及成像速度快，可进行生命过程的动力学研究；(5)不需要任何透镜，体积小。5离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一
43、种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的 pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的 pH。当 pH 较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多；在 pH 较高时，蛋白质的电性与低 pH 时相反。当蛋白质所处的 pH 使蛋白质的正负电荷相等，此时的 pH 称为等电点。离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团制成的，可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如 DEAE-纤维素树脂；反之称为阳离子交换剂，如 CM-纤维素树脂。不同的蛋白质有不同的等电点，在
44、一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时，亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此，可通过增加缓冲液的离子强度和或改变酸碱度，就可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。6光学显微镜的使用容易得多，并且需要的设备也简单得多。它易于分辨 1Pm 大小的物体，分辨率下限为 02 btm，这是由可见光波长决定的一个理论极限。由于可见光是非破坏性的，容易透过水，从而可用光学显微镜来观察活细胞。另一方面，电子显微镜技术要复杂得多，在样品制备(需要超薄切片，以电子致密的重金属染色，并且完全脱水)及仪器性能这两方面都要复杂许多。不能用于观察活细胞。然而电子显微镜的分辨率很高，观察任何超微结构，如微管、线粒体与细菌，需要用电子显微镜加以分析。7动物体细胞克隆技术的成功对生命科学的发展具有重要的推动作用，不仅证明了动物的体细胞具有全能性，而且有巨大的应用前景，例如，结合转基因技术生产药物等。现在很多药物
