1、遗传学实验报告拟 南 芥 T-DNA 插 入 突 变 体 的 鉴 定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物 DNA 的 CTAB 提取法，掌握 PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解 T-DNA 插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。 植株形态个体小，高度只有 30cm 左右； 生长周期快，从播种到收获种子一般只需 8 周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养； 遗传转化简单，转化效率高； 基因组小，只有 5 对染色
2、体， 125MB； 在 2000 年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物 。2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。拟南芥诱变常用方法有 EMS 诱变、T-DNA 插入突变、激活标签。 由于 T-DNA 插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA 插入突变体； SALK 中心提供的拟南芥 T-DNA 插入突变体超过十万种。3、 T-DNA 插入突变原理T-DNA，转移 DNA（transferred DNA ） ，是根瘤农杆菌 Ti 质粒中的一段 DNA 序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组 。人们将目
3、的基因插入到经过改造的 T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。除用于转基因以外，T-DNA 插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA 大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。4、 T-DNA 插入突变体 PCR 鉴定图 1 结果鉴定 图 2 PCR 引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA 插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR 仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB 提取液，氯仿/异戊醇（24：1） ，无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2 ，引物，琼脂糖，溴化乙锭
4、（EB） 。四、实验步骤1、植物 DNA 提取方法（CTAB 法）1) 水浴加热 CTAB 提取液至 65 ；2) 取叶片 100mg, 液氮研磨成粉末；3) 加入 600l CTAB 提取液并混匀；4) 65 水浴 45min（至少 30min） ；5) 12,000rpm 离心 10min；6) 将上清转移到新离心管，加入等体积氯仿/异戊醇, 混匀；7) 12,000rpm 离心 5-10min, 将上清液转移到新管中；8) 向上清中加入 1/10 体积 3M NaAc,再加入预冷的等体积异丙醇或 2V 无水乙醇, 混匀冰上放置 10min；9) 12,000rpm 离心 10min，弃上
5、清，加入 500l 70乙醇洗涤 2min；10) 12,000rpm 离心 5min，弃上清，吸干残留并干燥；11) 加 20-50 l TE 缓冲液溶解 DNA。2、 PCR 反应1)引物设计 LP: 5-TCA TCC ACC ATG GAA GAA AAG RP: 5-TTG GAT ACG ATG CGA GTA AAC BP: 5- TTG TTC ACG TAG TGG GCC ATC G LP+RP:1107bp BP+RP: 560-860bp2） PCR 反应体系 H2O: 12.4 l 10Buffer: 2 l dNTP: 0.5 l MgCl2: 2 l LP/BP:
6、 0.5 l RP: 0.5 l Taq: 0.1 l DNA: 2 l Total: 20 l3)PCR 温度设定 94 5min 33 cycle 变性：94 30s 退火：53 30s 延伸：72 1min30s 72 7min3、琼脂糖凝胶电泳分析1) 500-1000bp：1.2%，Agarose 0.5TBE；2) 化胶时应注意不能沸出，冷却至约 60制胶，凝胶充分冷却凝固后点样进行电泳；3) PCR 产物加 3-4 l 6loading buffer；4) 120V 稳压电泳；5) EB 染色 10min，紫外观察。五、结果分析PCR 产物电泳截图结果如下图所示。1 2 3 4
7、5 6 7 8 9 10 11 12 13在图 3，第 7 泳道为 DL 2000 DNA marker，第 5 泳道是 BP-RP 引物体系，第六泳道是LP-RP 引物体系。BP-RP 体系的 PCR 产物产生一条略大于 750bp 的 DNA 条带，而 LP-RP 引物体系中没有在大致 900bp 的位置产生条带。由此，可以断定此样品为纯和突变体。六、思考与讨论1、加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。本次试验中，离心管出现了冰霜，可能对最后的结果有影响。2、 DNA 有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。3、加液氮碾磨时，注意不要将叶片挤到离心管的底部，那样会导致碾磨不充分。遇到这种情况，建议重做。4、 PCR 中所需的各种试剂都应避免污染，而且尽量减少冻融的次数。 图 3 PCR 产物电泳条带图
