1、芳酸及其酯类药物的分析,典型药物,鉴别试验,含量测定,体内药分,返回主目录,练习与思考,杂质检查,第六章,基本要求,基 本 要 求,一、掌握水杨酸类、苯甲酸类药物的鉴别和含量测定的基本原理与方法。二、熟悉其他芳酸类药物鉴别和含量测定的基本原理与方法。三、了解本类药物的体内分析方法。,返 回,一、水杨酸类（一）典型药物结构,第一节 典型药物分类与理化性质,水杨酸（salycylic acid）,阿司匹林（aspirin),对氨基水杨酸钠 （sodium aminosalicylate),双水杨酯（salsalate),贝诺酯（benorilate),1.酸性 SA(PKa2.95)、ASA(PK
2、a3.49)、双水杨酯均有酸性。2. 溶解性: 均为固体，有一定溶点。除钠盐溶于水，其余不溶。3. UV和IR光谱特性：分子结构中具有苯环,有UV和IR特征吸收。4. 芳伯氨基和酚羟基特性：5. 水解特性：ASA、双水杨酯及其制剂应检查水杨酸,对氨基水杨酸钠和贝诺酯检查间氨基酚和对氨基酚。,（二）主要理化性质,（一）典型药物结构,苯甲酸及其钠盐 (benzoic acid ）,二、苯甲酸类,羟苯乙酯(ethylparoben),丙磺舒(probenecid),甲芬那酸(mefenamic acid),（二）主要理化性质,1. 溶解性: 均为固体，有一定溶点。除钠盐溶于水，其余不溶。2. UV和
3、IR光谱特性：分子结构中具有苯环,有UV和IR特征吸收。3. 具有酚羟基特性：4.分解反应特性：苯甲酸钠分解为苯甲酸；丙磺舒分解为SO25. 酸性：苯甲酸、丙磺舒和甲芬那酸有游离的羧基 ，可用NaOH直接滴定测定其含量。,三、其他芳酸类 (一)典型药物结构,氯贝丁酯（clofibrate）,布洛芬（ibuprofen）,(二)主要理化性质 1.溶解性：水中不溶，有机溶剂溶解，氯贝丁酯为液体；布洛芬为固体，有一定熔点。2.UV和IR特征吸收光谱：基于分子结构中具有苯环和特征基团。,返 回,一、与三氯化铁反应含有酚羟基药物可与FeCl3反应；能与FeCl3反应不一定含酚羟基.,第二节 鉴别试验,1
4、. 直接反应SA在中性或弱酸性条件下，与FeCl3生成紫堇色配 位化合物,丙磺舒与NaOH成钠盐后，在pH 5.06.0中与FeCl3生成米黄色 布洛芬与高氯酸羟胺，N，N-双环基己羧二亚胺及高氯酸铁反应，即显紫色JP（14）方法。基于分子中-COOH的结构。,2. 水解或分解后与三氯化铁反应,ASA水解成SA后与FeCl3 反应，成紫堇色,二、重氮化-偶合反应凡是分子结构中含有芳伯氨基或潜在芳伯氨基的药物均可反应。,1. 直接反应 对氨基水杨酸钠2. 水解后反应 贝诺酯具有潜在芳伯氨基3. 甲芬那酸与对-硝基苯重氮盐在NaOH介质中偶合产生橙红色。,+ K2Cr2O7 深蓝色 棕绿色甲芬那酸
5、 + H2SO4黄色 绿色荧光JP(14),三、氧化反应,1. ASA酸水解生成SA和CH3COOH：SA的mp为156161 。(P118)2. 双水杨酯水解生成SA：SA的mp为158。3. 氯贝丁酯碱水解后与盐酸羟胺生成异羟肟酸盐，在弱酸条件下再与三氯化铁反应生成紫色的异羟肟酸铁。,四、水解反应,1. 苯甲酸盐加热分解生成苯甲酸升华物，可用于鉴别。2. 丙磺舒与NaOH熔融分解成Na2SO3, 经硝酸氧化成Na2SO4。 3. 丙磺舒加热分解，生成SO2气体，有臭味,五、分解产物反应,1. 测定max ；min。例如：布洛芬用0.4%NaOH溶液制备0.25mg/ml；max ； 265
6、nm, 273nm; min。245nm, 271nm。2. 在max 处测定一定浓度供试液的吸收度A。例如：羟苯乙酯，5g/ml max =295nm; A = 0.483. 在max 处测定供试液的百分吸收系数。例如：贝诺酯在max =240nm; E1%1cm = 730760,六、紫外吸收光谱法,4. 在规定的波长测定吸收度比值（即双波长吸收度比值法） 例如：对氨基水杨酸钠10g/ml; A265/A299 = 1.561.56 再例如：甲芬那酸14g/ml; A278280/A348352 = 1.151.30,七、红外吸收光谱法,水杨酸的红外吸收图谱,37002900cm-1,N-
7、H、 O-H,1660cm-1,C=O,1610,1570 1480,1440,C=C,775cm-1,Ar-H,返 回,37002900cm-1,N-H、 O-H,1640cm-1,N-H,1580cm-1 1500cm-1,C=C,1300cm-1,C-N,1188cm-1,C-O,对氨基水杨酸钠的红外吸收图谱,第三节 特殊杂质检查,一、ASA中特殊杂质的检查1.溶液的澄清度 主要检查Na2CO3中不溶物，有苯酚；醋酸苯酯；水杨酸苯酯；乙酰水杨酸苯酯。ASA溶解因此ASA溶液应澄清。2. 游离水杨酸检查 利用SA 可与FeCl3呈色，用比色法检查。3. 易炭化物检查 主要检查ASA中能被硫
8、酸炭化显色的低分子有机杂质。采用与标准比色液比色的方法检查。,主要检查成品药物中可能残留的间氨基酚。间氨基酚易氧化呈色，而且有毒性，因此要严格控制。双相滴定法：利用间氨基酚溶于乙醚，取3.0g 样品用乙醚提取,0.02mol/LHCl 测定方法 滴定V0.3ml。HPLC法：采用内标法，以磺胺作内标（USP）,二、对氨基水杨酸钠中特殊杂质的检查,?三、羟苯乙酯中有关物质的检查,BP收载的方法，由于杂质的结构不清，故采用TLC法中的 供试品自身对照法：,固定相：GF254C18化学键合硅胶,展开剂：甲醇-水-冰醋酸,反相TLC法,甲芬那酸是以邻-氯苯甲酸和2，3-二甲基苯胺在Cu的催化下缩合而成
9、，因此成品药物中要检查铜盐及有关物质。分光光度法：利用Cu 2+与Na-DDC呈色后测定A1. 铜盐检查法 原子吸收分光光度法：BP（2000）2. 有关物质的检查 主要检查的是酰胺、二甲基苯胺和邻氯苯甲酸各国药典均采用TLC法中的自身高低浓度对照法。,?四、甲芬那酸中特殊杂质的检查,?五、氯贝丁酯中特殊杂质的检查,主要检查成品药物中残留的对氯酚原料和挥发性杂质,GC-FID法,HPLC法：以对-羟乙基酚作内标，用正相HPLC,2. 挥发性杂质的检查方法 GC法,1. 对氯酚检查,返 回,含量测定,1 酸碱滴定法 1）直接滴定法2）水解后剩余滴定法3）两步滴定法 2 亚硝酸钠滴定法 3 双相滴
10、定 4 紫外分光光度法 5 HPLC,一、酸碱滴定法 （一）直接滴定法 基于本类药物-COOH；可用碱直接滴定，如ASA的含量测定，其原理如下：,第四节 含量测定,1. 原理：,2. 条件：,在中性乙醇(防止阿司匹林水解，使结果偏高，不用中性乙醇溶解)中，以酚酞作指示剂；摩尔比为1:1。,3. 应用：,多国药典用于双水杨酯、苯甲酸、丙磺舒、布洛芬测定；USP和BP还用于甲芬那酸的测定。,（二）水解后剩余滴定法1. ASA含量测定,原理：,条件：,水溶液,具体试验：,I 份NaOH,I 份NaOH,V,VO,Vo-V相当于ASA消耗硫酸的ml数,ASA% = (Vo V)FT/W 100%,P1
11、29 T的计算,2. 羟苯乙酯的含量测定,（三）两步滴定法,1. ASA片的含量测定,第一步为中和,ASA + NaOH,ASA-Na + H2O,水解产物SA + NaOH,SA-Na + H2O,酸性稳定剂+ NaOH,中性盐,第二步为水 解与测定,含量计算 每1ml的硫酸滴定液（0.05mol/l）相当于18.02mg的C9H8O4。,P130,2. 氯贝丁酯含量测定 第一步：中和酸性杂质第二步：水解与测定,二、亚硝酸钠滴定法,对氨基水杨酸钠有芳伯氨基,在HCl中与 NaNO2发生重氮化反应,Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl,Ar-N2Cl + NaCl + 2H2O,因此可用
12、亚硝酸钠滴定法测定其含量，此法在下章重点讨论。,三、双相滴定法,是指在水相和有机相中的滴定。如苯甲酸钠的含量测定：,生成的苯甲酸不溶于水，终点pH突跃不明显，不易观察。苯甲酸在乙醚中易溶，在水相中加入乙醚将滴定中产生的苯甲酸萃取入醚层。因此用双相滴定可使反应完全终点明显。,（一）直接紫外分光光度法丙磺舒片的测定：Ch.P(2000) 在HCl中，采用百分吸收系数法。BP(1998)再盐酸-乙醇,采用百分吸收系数法.USP(24)用氯仿提取后，采用对照品比较法。,四、紫外分光光度法,（二）离子交换-紫外分光光度法,氯贝丁酯及其制剂 Ch.P(2000)采用酸碱滴定法；当含有酸性杂质对氯酚时，可采
13、用强碱性阴离子交换树脂吸附酸性杂质后，在甲醇溶液中，226nm波长处，采用对照品比较法。具体计算：W1000 1/100 1/100 = Cu (g/ml)Au/As = Cu/C Cu = C(Au/As)W(mg) = 10 Cu = 10 C(Au/As),P 132,（三）柱分配色谱-紫外分光光度法,USP(24)采用此法同时测定ASA胶囊中ASA和SA。1. SA的限量测定色谱柱的制备；对照品溶液的制备；供试品溶液的制备。,供试品液：CHCl3液,洗脱液1：CHCl3 洗脱液2：HAC-乙醚,硅藻土，FeCl3-尿素,玻璃棉,硅藻土，Na2CO3,供试品液：CHCl3-HCl液,洗脱
14、液1：HAC-CHCl3(1:10) 10ml 洗脱液2：HAC- CHCl3(1:100) 85ml,1-杂质先洗脱 2-SA后洗脱,max=306nmAuAs,1-杂质先洗脱 2-ASA后洗脱,max=280nm ASA(mg)=C(Au/As),2. ASA的含量测定色谱柱的制备；对照品溶液的制备；供试品溶液的制备。,Ch.P(2000)ASA的胶囊剂的含量测定采用此法。USP（24）ASA片、对氨基水杨酸钠、甲芬那酸、布洛芬、丙磺舒等及其制剂，采用此法。,五、HPLC法,P 133,（一）ASA栓剂的含量测定,色谱条件：色谱柱ODSC18；流动相为甲醇：0.1%二乙胺：HAC(40:6
15、0:4);检测波长280nm；内标物为咖啡因。 系统适用性试验： n 2000; ASA与SA与内标物的R 1.5 具体计算： Cx = Rx/RRCRW(g) 1/50 2/50 = CxW测 = 1250 Cx,标示量% = W测/W W平/标示量100% = Cx 1250 W平/W 标示量100%,色谱条件：色谱柱苯基硅胶柱；流动相为NaH2PO4 0.1% HAC液-0.1% HAC乙腈液(50:50);检测波长254nm。系统适用性试验： n 3900; T 2.3; 重复性 RSD1.5%具体计算：,（二）丙磺舒原料的含量测定,W 1/100 = Cu(mg/ml); Cu =
16、Au/As C供试品中丙磺舒(Mg)=100C(Au/As),返 回,一、血清中ASA和SA浓度的HPLC法色谱条件：色谱柱为ODS-C18(150mm 4.6mm, 5m)流动相为甲醇-水-正丁醇(30 :20 :1)检测波长为237nm；内标物为苯甲酸。血清样品预处理血清100 l + HClO450 l + 不同浓度ASA和SA + 内标液涡旋混合2min 离心5min 取上清液20 l进样。,第五节 体内药物分析,回归方程：以峰高比（H标/H内）对浓度回归ASA的回归方程：Y = 5.810-3 + 5.2910-2X r = 0.9996SA的回归方程：Y = 6.010-3 + 8
17、.3310-2X r = 0.9981ASA和SA的线性范围分别为：120 g/ml; 230 g/ml 回收率：空白血清 + 五种不同浓度测定，ASA为96.0%106.0%;SA为92.0%119.5%;（五种不同浓度均应在线性范围内）,色谱条件：色谱柱为LiChrospher100RP(125mm4mm, 5m)流动相为25%乙腈溶液-醋酸缓冲溶液梯度洗脱。检测波长为254nm；内标物为依他尼酸。 尿样品预处理：C8固相萃取柱，100mg填料/ml用甲醇1.0ml,然后用0.5ml蒸馏水活化。2.0ml尿样 + 内标300l(10g/ml) 上柱 1.0ml水洗脱生物杂质 再用甲醇0.5
18、ml洗脱保留在柱上的丙磺舒和内标。洗脱液0.45m浸滤膜滤过，取5l直接进样分析。,二、尿中丙磺舒的固相萃取净化-HPLC法(运动员违禁药物),线性关系和回收率：取空白尿样2.0ml +不同浓度丙磺舒+内标液 按上述方法 分析(浓度范围为0.1g/ml 100g/ml) ;A丙/A内对C丙回归。 回收率：丙磺舒为100%3%(n=14)；内标为101%3%(n=12)； 人尿样测定：丙磺舒(单剂量500mg)尿排泄药-时曲线(见P136),三、HPLC法测定人血浆中布洛芬含量色谱条件：色谱柱为Shim-packCLC-ODS(150mm6mm, 10m)预柱为YWG-C18；流动相为甲醇-20
19、mol/L磷酸二氢钾冲溶液(70:30, pH=4.0); 流速为1.0ml/min;检测波长为221nm；内标物为肉桂酸。样品预处理：取肝素抗凝血浆0。24ml+内标液+甲醇0.5ml,振荡混匀，离心(1000r/min)15min,取上清液10 l直接进样分析。布洛芬和肉桂酸tR为5.15和2.85min。,回归方程：以对照品与内标的峰高比对浓度回归，其回归方程为：Y = 4.05 10-2C 2.0 10-3, r = 0.9999。 回收率测定：空白血浆 + 布洛芬对照品高、中、低三种浓度，按样品处理项下测定，测得平均回收率为99.2 1.6%。 精密度：日内精密度为RSD1.8%；日
20、间精密度为2.8%。,1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0h自肘静脉取血1.5ml，肝素抗凝，按“样品处理方法”项下操作，求算血药浓度，结果见P137表61。试验结果：1.血浆用甲醇除蛋白后，直接进样，经预柱净化，再进分析柱回收率高，分析速度快(6min完成)，分离效果好。2.口服一次后Tmax = 30min90min；体内维持4h6h。与文献报道的结果一致。3.本法可用于临床治疗药物浓度检测和药代动力学研究。,人血浆样品测定：受试者8人；给药剂量600mg，给药后0.5，0.75,返 回,练习与思考,A型题,1阿斯匹林中检查的特殊杂质是 A.水杨醛 B
21、.砷盐 C.水杨酸 D.苯甲酸 E.苯酚 2对氨基水杨酸钠中检查的特殊杂质是 A.水杨醛 B. 间氨基酚 C.水杨酸 D.苯甲酸 E.苯酚,B型题,FeCl3反应 B.水解后FeCl3反应 C. AgNO3反应 D.重氮化-偶合反应 E. 麦芽酚反应1. 阿斯匹林 2. 水杨酸3. SMZ4. 苯甲酸钠,B,A,D,A,A. 直接酸碱滴定法 B. 两步酸碱滴定法 C. 亚硝酸钠溶液滴定法 D. HPLC法 E. 双相滴定法 5. 苯甲酸钠 6. 阿斯匹林 7. 阿斯匹林栓剂 8. 对氨基水杨酸钠,E,B,D,C,X型题,1. 直接能与FeCl3产生颜色反应的药物有 A。水杨酸 B. 盐酸普鲁卡因 C. 对氨基水杨酸钠 D. 对氨基酚 E. 阿斯匹林 2. 能发生重氮化-偶合反应的药物有 A。水杨酸 B. 阿斯匹林 C. 对氨基水杨酸钠 D. 对氨基酚 E. 盐酸普鲁卡因,返 回,
