1、第五章培养基及设备的灭菌,本章讲述的内容,第一节 培养基灭菌的目的、要求和方法第二节 湿热灭菌的理论基础 第三节 培养基灭菌的工程设计,第一节培养基灭菌的目的、要求和方法,一、定义 1，培养基灭菌的定义 是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。,2，灭菌与消毒的区别 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。,二、培养基灭菌的目的,1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力； 在
2、连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主； 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 杂菌会降解目的产物； 杂菌会污染最终产品； 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。,2，工业上具体措施包括：1）使用的培养基和设备须经灭菌；2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的纯粹种子。,3，培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。,4，培养基灭菌的要求 达到要求的无菌程度（10-3） 尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两
3、个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,5，灭菌的方法化学法 化学药品灭菌法: 0.1%0.25%KMnO4溶液、0.5%1%漂白粉溶液、75%酒精、0.25%新洁尔灭、10%甲醛溶液、苯酚溶液、来苏尔,物理法,干热灭菌法:进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160170 ，11.5 h。 实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。,射线灭菌
4、法,以紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超过1.2 m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。,过滤除菌法,利用过滤方法阻留微生物，也可达到除菌的目的，这就是过滤除菌法。 此法仅适用于澄清液体和气体的除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物培养过程使用。,小颗粒的相对尺寸,湿热灭菌法,利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热芽孢杆菌来说，温度升高10 时，灭菌速度常数可增加810倍，对营养细胞更高。蒸汽
5、来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条件为121 ，30 min。,1)，湿热灭菌的原理每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。借助蒸汽释放的热能使微生物中的蛋白质,酶,核酸分子内部的化学键,特别是氢键受到破坏,引起不可逆的变性,使微生物死亡,2)，湿热灭菌中的相关定义 杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死
6、温度以上，温度愈高，致死时间愈短。 微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。 芽孢的热阻特别高的原因：芽孢具有吡啶二羧酸，能增强对热抵抗力芽孢厚而且结构致密，热不易透过芽孢的游离水分少，蛋白质含水量较营养细胞蛋白质含水量低。在实际生产中，由于不能完全了解杂菌的数量和类型，因此要以相对热阻大的芽孢作为灭菌的依据。,各种微生物对湿热的相对热阻,3)，湿热灭菌的优缺点 优点 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； 蒸汽有很大的潜热； 操作方便，易管理
7、。 缺点:蒸汽直接加到培养基,带来水分,细胞浓度发生变化,关键因素影响很大,蒸汽量算进去 ,怕湿的 不能,碳酸钙变成氧化钙,不能同时 加进去 .尿素灭菌与培养基的灭菌不同 .物料的不同灭菌要求,第二节 湿热灭菌的理论基础,一、培养基湿热灭菌需解决的工程问题 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。 灭菌温度和时间的确定取决于： 杂菌孢子的热灭死动力学 反应器的形式和操作方式 培养基中有效成分受热破坏的可接受范围,二、微生物的热死灭动力学方程 实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：（1）N：任一时刻的活细
8、菌浓度（个/L）t：时间（min）K：比热死速率常数（min-1）,100时不同时间活菌的存活数,取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得（2） 或 （3）,同一微生物,温度不同k不 同,一般温度月底,k越小,温度高,k值大,相同温度下,k越小越耐热,121下细菌芽孢的k为1min,营养细胞10-1010,实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。,三、温度对K的影响(灭菌温度的选择) 微生物的热死灭动力学
9、接近一级反应动力学 它的比热死灭速率常数K与灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方程表征（4）A：频率因子（min-1） E：活化能（J/mol）R：通用气体常数J/（mol.k）,从（4）可以看出： 活化能E的大小对K值有重大影响。其它条件相同时， E越高，K越低，热死速率越慢。 不同菌的孢子的热死灭反应E可能各不相同。 对（4）两边取对数，得（5） K是E和T的函数，K的对T的变化率与有关，对（5）两边取 T的导数，得（6）,（4）,（5）,1/T,K（min-1）,K是E和T的函数，K对T的变化率与E有关,由（6）可得出结论：反应的E越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K的影响越大,（6
10、）,培养基成份受热破坏的化学分解反应也符合,灭菌过程中,当温度变化时,活菌死亡动力学常数k和培养基成分 破坏速度常数 k都变化,温度 由T1升高到 T2,K分别为,微生物的灭菌两式相除并取对数得,培养基成分的破坏也有类似关系,两式相除,试验表明，细菌孢子热死灭反应的E很高，而某些有效成分热破坏反应的E较低。即随着温度的升高,灭菌速率常数增加的倍数大于培养基成分分解的速度常数的增加倍数. 将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的E很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少,B族维生素和细菌芽孢的活化能,EBS=67
11、000 4.184（J/mol） EVB=22000 4.184 （J/mol） 将灭菌温度从105C提高到127 C KVB从0.02（min-1）提高到0.06（min -1 ） KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min -1 ）,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和 维生素B1的lnK-1/T图,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响,第三节 培养基灭菌的工程设计,一、无菌的标准 根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3,二、分批灭菌 1，分批灭菌的设计(间歇灭菌或实罐灭菌)间歇灭
12、菌即实消，是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。 规模较小的发酵罐往往采用分批灭菌的方法。这种方法不需要其它设备，操作简单易行，故获得较普遍采用。其缺点是加热和冷却所需时间较长，增加了发酵前的准备时间，也就相应地延长了发酵周期，使发酵罐的利用率降低。所以大型发酵罐采用这种方法在经济上是不合理的。同时，分批灭菌无法采用高温短时间灭菌，因而不可避免地使培养基中营养成分遭到一定程度的破坏。但是对于极易发泡或粘度很大难以连续灭菌的培养基，即使对于大型发酵罐也不得不仍然采用分批灭菌的方法。分批灭菌仍被许多工厂采
13、用,在发酵罐中进行实罐灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程,孢子热死亡的规律符合,因为升温、冷却阶段T是时间t的函数，K不是常数，所以：（7）（8）（9）式中Kh是保温阶段的孢子比热死亡速度常数,分批灭菌中几种换热方式的温度-时间变化关系T：介质温度（K）；T0：介质初温（K）；t：时间（min）； h：蒸汽相对于介质的热焓（kJ/kg）；s：蒸汽的重量流率（kg/min） M：介质重量(kg)；Cp：介质比热kJ/(kg.K)； TH：热源温度(K) U：总传热系数kJ/（m2.min.K）；q：传热速率（kJ/min） Cp：冷却剂比热；W：冷却剂流率；TCO：冷却剂温度,参见 微生物
14、工程工艺原理P226 伦世仪主编生化工程P13。,2，保证间歇灭菌成功的要素 内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象 压力稳定的蒸汽 合理的操作方法。,发酵罐的接管图,3，培养基间歇灭菌过程中应注意的问题,温度和压力的关系 泡沫问题 投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在罐壁上残留的问题 灭菌结束后应立即引入无菌空气保压,三、连续灭菌的设计,培养基的连续灭菌，就是将配好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌,1，连续灭菌的流程,上图为连续灭菌过程中温度的变化情况。由图可以看出，连续灭菌时，培养基可在短时间内加热到保温温度，并且能很快地冷却，因
15、此可在比间歇灭菌更高的温度下进行灭菌，而由于灭菌温度很高，保温时间就相应地可以很短，极有利于减少培 养基中的营养物质的破坏。,在连续灭菌过程中， 1.蒸汽用量虽平稳，但气压一般要求高于0.5Mpa（表压）。 2.连消设备比较复杂，投资较大。采用连续灭菌时，发酵罐应在连续灭菌开始前先进行空消，以容纳经过灭菌的培养基。 3.加热器、维持罐和冷却器也应先进行灭菌，然后才能进行培养基连续灭菌。 4.组成培养基的耐热性物料和不耐热性物料可在不同温度下分开灭菌，以减少物料受热破坏的程度，也可将糖和氮源分开灭菌，以免醛基与氨基发生反应而生成有害物质。,5.对于粘度过高或固体成分较多的培养基要实现连消困难较多
16、，主要是灭菌的均匀度问题。设计这类物料的连消设备必须避免管道过长，或尽可能将淀粉质物料先行液化。,图是一种连消塔、维持罐、喷淋冷却的连续灭菌流程。配好的培养基用泵打入 连消塔与蒸汽直接混合，达到灭菌温度后进入维持罐，维持一定时间后经喷淋 冷却器冷却至一定温度后进入发酵罐。连续灭菌的基本设备一般包括（1）配 料预热罐，将配好的料液预热到6070，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度 相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽 与料液迅速接触混合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126132）； （3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的；（4） 冷却管，
17、从维持罐出来的料液要经过冷却管进行冷却，生产上一般采用冷水喷 淋冷却，冷却到4050后，输送到预先已经灭菌过的罐内。,（一）连消塔喷淋冷却流程,（二）喷射加热真空冷却流程,（三）板式换热器灭菌流程,该流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，培养液在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程，蒸汽加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一段时间，然后在薄板换热器的另一段冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。虽然利用板式热交换器进行连续灭菌时，加热和冷却培养液所需要的时间比使用喷射式连续灭菌稍长，但灭菌周期则较间歇灭菌小得多。由于待灭菌培养液的预热过程同时为灭菌培养液的冷却
18、过程，所以节约了蒸汽及冷却水的用量。,2、连续灭菌设备的结构及计算 （1）设备结构： 套管式连消塔 又称加热器，是培养基于蒸汽混合加热至灭菌温度的设备。要求在2030s或更短的时间内将料液加热至130140。生产中一般用0.50.8Mpa的活蒸汽与预热后的料液直接接触而加热。 连消塔用内外两根管子套合组成，内管开有45向下倾斜的小孔，孔径一般为6mm，蒸汽由此喷出。孔距应从上到下减少，使蒸汽较为均匀。培养基由塔底进入，与小孔中喷出的蒸汽连续混合后在塔上部流出。培养基在塔内停留时间一般取2030s；线速度要求0.1m/s,喷嘴式连消塔： 培养基以较高流速从中间管喷入，蒸汽从管外环隙同时喷入，在器
19、内进行混合，为了增加混合效果，器内设置一块弧形挡板。与近3m高的连消塔比较，尺寸大为减少，其高度仅为0.5m左右，使用效果也很好。此种形式的连消器实际上已接近于喷射加热器。,连消器,维持罐 灭菌系统中的维持设备，主要是使加热后的培养基在维持设备中保温一段时间，以达到灭菌的目的，因此，也可称保温设备。维持设备一般不需另行加热，但必须在维持设备的外壁用绝热材料进行绝热，以免培养基冷却。维持罐为长圆筒形，高为直径的24倍，上下封头为球形，如图所示。罐顶部设有人孔1，进料管2由圆筒上部侧面伸入后，在罐内通至下部，使料液自下向上流动，至上部侧面接管3流出，要防止进料管2上部弯头处受料液磨损而使料液短路，
20、引起低温灭菌时间不够而染菌。罐上部留有空间，以便安装压力表和排汽管。压力表管安装成向下弯，以免管内冷凝污水落入维持管内而污染料液，同时便于观察压力。圆筒中部有温度计测温孔4。罐的有效容积应能满足维持时间为825min的需要。停止操作时，料液由管5排尽。,喷射式加热器的特点是蒸汽和料液迅速接触，充分混合，加热是在瞬时内完成的。简单的喷射式加热器仅是一个喷嘴装置，蒸汽由喷嘴喷出，料液从侧面进入器内而被蒸汽加热。工厂中较常见的是一种在下游具有扩大室的喷射加热器。此种加热器的喷嘴部分与一般喷嘴不同，料液在中间进入，蒸汽则在周围环隙中进入，同时下游有一个扩大室以使料液进入，蒸汽则在周围环隙中进入，同时下
21、游有一个扩大室以使料液在进入加热器时的流速约为1.2m/s左右，蒸汽喷口的环隙面积约为喷嘴外径的一倍，扩大管高度一般为1米左右。此种加热器结构简单，轻巧省料，且在操作过程中无噪声。,薄板换热器,冷却设备,冷却设备是将已灭菌的培养基加以冷却的设备，通常采用的是喷淋冷却器，也可考虑用套管冷却器。 喷淋冷却器是将水通过喷淋装置均匀地淋在水平的排管上，以冷却管内的培养基。培养基一般由排管下部进入，而由上部排出，流体在管内的流速约为0.3m/s。它具有结构简单，清洗方便的优点，且由于部分淋下的水滴在管表面被高温的管壁所汽化，其传热效率较高，传热系数为300kcal/m2h左右，被广泛地用于连续灭菌过程中
22、。 套管冷却器是一种内管走热培养基，内外管间的管隙中走冷却水的冷却器。操作时，冷热两流体流向相反，以提高平均温度差，节约用水。若将所制培养基代替冷却水，则培养基可获得预热的作用。此种冷却器与喷淋冷却器相比，消耗钢材较多，且内管有漏洞时不易被发现而引起严重污染，但其热利用较合理，传热系数较高，一般可达400 kcal/m2h。,（2）连消塔及维持罐体积的计算 A:连消塔 培养液在管间流动，线速度为 ，则：式中 培养液流速，m/s； G培养液流量，m3/h，蒸汽冷凝量使培养液量增加，但对灭菌设备中有关因素的影响是很小的，可以略而不计； D外管直径，m； d内管直径，m。,则塔高式中 H 连消塔高，
23、m；灭菌时间，s。 内管蒸汽喷孔总面积和孔数计算： 根据蒸汽消耗量（m3/h）等于从小孔喷出的蒸汽量（m3/h）得：则式中 F蒸汽喷孔的总面积，m3； 蒸汽喷孔的速度，m/s，通常采用2540m/s V加热蒸汽消耗量，m3/h。,加热蒸汽喷孔数 为：式中 n 喷孔数，个； d1喷孔直径，m。,B维持罐 维持罐容积由下式计算：式中 V 维持罐容积，m3； v料液体积流量，m3/h； t维持时间，min，取经验数据为825min，不同类型的发酵维持时间不同； 充满系数，取0.850.9。,4，连续灭菌设计及计算举例 参见 课本8384页 课后作业一台连续灭菌器的灭菌温度是129.5度,要求在40m
24、in内对30m3的培养基进行灭菌,培养基的原始污染度是105个菌/cm3,要求灭菌后30m3培养基 中只有 一个 菌,试计算灭菌时间应多长?,四、连续灭菌与间歇灭菌的比较,1，连续灭菌的优缺点 优点 保留较多的营养质量 容易放大 较易自动控制； 糖受蒸汽的影响较少； 缩短灭菌周期； 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均匀。 缺点 设备比较复杂，投资较大。,2，分批灭菌的优缺点 优点 设备投资较少 染菌的危险性较小 人工操作较方便 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜 缺点 灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。,五、影响灭菌的因素
25、,培养基成分对灭菌的影响 油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。 培养基的物理状态对灭菌的影响 培养基中微生物数量对灭菌的影响 培养基中氢离子浓度对灭菌的影响 培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的 酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越低。,微生物细胞中水分对灭菌的影响 细胞含水越多，蛋白质变性的温度越底 微生物细胞菌龄对灭菌的影响 老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高 空气排除情况对灭菌的影响 搅拌对灭菌的影响 泡沫对灭菌的影响,六、发酵罐的灭菌,培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。,七、补料液的灭菌,在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。 灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。 如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。 也有利用过滤法对另补料液进行除菌。 补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。 所有的附属设备和管道都要经过灭菌。,
