1、第七章 细胞质基质与细胞内膜系统,第一节 细胞质基质的涵义与功能一、细胞基质的涵义二、细胞基质的功能,第二节 细胞内膜系统及其功能一、内质网的形态结构与功能二、高尔基体的形态与功能三、溶酶体的形态与功能,第三节 细胞内蛋白质的分选与膜泡运输一、信号假说与蛋白质分选信号二、蛋白质分选的基本途径与类型三、膜泡运输四、细胞机构体系的组装,细胞内被膜区, 细胞质基质（Cytoplasmic matrix) 细胞内膜系统（endomembrane system) 其他被膜包被的细胞器（线粒体、叶绿体、过氧化酶体和细胞核),第一节 细胞质基质的涵义与功能,细胞质基质（Cytosol, Cytoplasmi
2、c matrix）细胞质基质的功能,细胞质基质（Cytosol, Cytoplasmic Matrix ）,细胞质基质:在细胞中，除去可分辨的细胞器以外的胶状物质，细胞的重要的结构成分，其体积约占细胞质的一半。,肝细胞中细胞质基质和细胞其他组分的数目及所占的体积比,一、细胞质基质的涵义,在细胞基质中，各种复杂的代谢反应是如何有条不紊地进行，各个代谢环节之间又是如何相互关联、相互制约的？,数以千种的生物大分子和代谢产物（或底物）又是如何定向地转运？,调节细胞增殖、分化、衰老与凋亡等重大生命活动的细胞转导途径又是怎么传递与整合的？,细胞基质,细胞液（Cell sap) 透明质(Hyaloplasm
3、) 胞质溶液(cytosol) 细胞基质(Cytoplasmic Matrix) 细胞基质看成是酶溶液 细胞基质很可能是高度有组织的体系,根据细胞基质中各种生物大分子结构的实际数目与相对大小所绘制的细胞基质结构的示意图,The microtrabecular lattice（微梁网络） of the cytoplasmic matrix in an unextracted cell.,基本概念 用差速离心的方法分离细胞匀浆物中个组分，先后除去细胞核、线粒体、溶酶体、高尔基体和细胞质膜等细胞器或细胞结构后，存留在上清液中的主要是细胞质基质的成分。生物化学家多称之为胞质溶胶。 主要成分：中间代谢有
4、关的数千种酶类、细胞质骨架结构。,细胞基质的成分,免疫荧光技术：酵解过程有关蛋白结合在微丝上 原位杂交技术：mRNA在细胞中区域性分布 卵母细胞中不同的mRNA在细胞质的不同的部位 酵解有关的酶类，彼此之间以弱键结合在一起形成酶的复合体，定位在细胞基质的特定部位，催化细胞的葡萄糖和丙酮酸的一系列反应。,细胞超微结构与生物化学等不同的侧面互相结合来研究细胞质基质的特殊的复杂的结构体系。,在细胞质基质中，蛋白质与蛋白质之间，蛋白质与其它大分子之间的相互作用都是通过非常弱的键来进行，并且常常处于动态平衡之中，这种结构体系的维持只能在高浓度的蛋白质及特定的离子环境的条件之下实现。,细胞质基质与胞质溶胶
5、,细胞质基质主要是由微管、微丝和中等纤维等形成的相互联系的结构体系，其中蛋白质和其它分子以凝聚状态或暂时的凝聚状态存在，它与周围的溶液即周围水相中的分子处于动态平衡。,胞质溶胶的成分是否与细胞质基质周围溶液的成分相同？,Paine把乳胶小球注射到非洲爪蟾的卵母细胞经过一段时间之后，取出乳胶小球。 SDS-PASE双向凝胶电泳技术。 结果发现，在所检测到的90多种多肽中，80的多肽未曾扩散到乳胶小球中，而结合在细胞质基质上。 另一些实验表明，mRNA和核糖体也都是结合在细胞质基质上。,用差速离心的方法所获得的胞质溶胶的成分与细胞质基质周围的溶液成分有很大的不同。胞质溶胶中的多数蛋白质，特别是分子
6、量较大的蛋白质，可能通过较弱的次级键直接或间接地结合在细胞质基质的纤维上。,（一）概念,1、经典细胞学:电镜下，除去可见的细胞器及其亚微结构以外的细胞质部分称为细胞质基质. 2、细胞生物学:分级离心后，除去所有细胞器和颗粒剩下的清液部分称为胞质溶胶. 学术争议: 细胞骨架不属于细胞质基质的范畴，是细胞器， 细胞骨架是细胞质基质的主要结构体系，是其他成分锚定的骨架，同时它们经常处于装配和解聚的动态平衡中，其解聚的亚单位仍保持在液相中。,（二）化学组成,成分复杂，不易分析，所以，反映了大部分细胞生化成分，即是许多细胞器生化反应的底物和产物的运输通道，本身又涉及了几种细胞代谢途径。 离心分离中，易发
7、生混杂和丢失，破碎的细胞器及液泡内含物可能混入可溶相，而另外一些本属基质的物质，如可溶性酶又可依附在细胞器碎片上被分离掉。,1、细胞生化活动的场所，糖酵解、脂肪酸合成，有些供细胞自身结构和代谢所需蛋白（如组蛋白、非组蛋白、肌球蛋白，核糖体蛋白都在游离核糖体中合成。 2、维持细胞器稳定，提供适宜离子环境 3、供应细胞器内发生反应的底物 4、对蛋白质修饰选择性降解和构象修正 磷酸化与去磷酸化，糖基化，甲基化，酰基化 蛋白质降解途径 热休克蛋白HSP帮助变性或畸形蛋白质重新折叠 5、物质贮存和运输，如:膜系统和细胞骨架系统解聚后的物质均贮存于细胞质基质中，被称为“分子库”，当需重新组装时由此提供元件
8、。,二、细胞质基质的功能,第二节、细胞内膜系统（endomembrane system）及其功能,内质网的结构与功能 高尔基体的形态结构与功能 溶酶体的形态结构与功能,1. 细胞内膜系统概述,细胞内膜系统是指细胞内在结构、功能及发生上相关的由膜包绕形成的细胞器或细胞结构。 真核细胞细胞内的区域化 （compartmentalization）： 细胞骨架纤维为组织者的Cytomatrix形成有序的动态结构； 细胞内的膜相结构细胞器（organelles）。,2.细胞内膜系统的研究方法, 差速离心分离与功能分析（De Duve, A.Claude and G.Palade,1974 Nobel P
9、lrize） 放射自显影（Autoradiography） 生化分析（Biochemical analysis） 遗传突变分析（Genetic mutants）,de Duve，G.Palade，分离到了但八只合成和分泌功能的结构。 细胞被破碎，膜碎片形成小囊泡， 小囊泡来自于不同的膜结合细胞器(细胞核、线粒体、质膜、内质网等) 来自于内膜系统的小囊泡称微粒体（microsome),差速离心分离与功能分析,放射自显影:用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等， 其原理:是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间
10、后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对 标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。,4.2 Overview of the exocytic pathway,All eukaryotes have the same complement of core exocytic compartments: ER, Golgi, Post-Golgi transport vesicles The pathway
11、 was revealed by “Pulse-Chase” experiment. Secretory pathway identified by Palade et al. They radiolabeled newly synthesized proteins and determined their locations. 3 labeling and the immediate autoradiography 3 labeling, 7 chase, and autoradiography 3 labeling, 120 chase, and autoradiography,Prote
12、ins were localized toi) rERii) Golgiiii) Secretory vesiclesER Golgi Secretory Vesicles cell exterior,http:/ Chapter 17 VSVG-GFP secretion video,Pulse-chase experiment,Label cells with radioisotopes Chase w/ cold amino acids Find the radioisotope in time course( ),EM Autoradiography,Introduce radio-l
13、abeled membrane precursors into the cytosol T = 0,cell,Radiolabel in cytosol,Wait 10, 30, 60, 90 minutes,Overlay an emulsion “sensitive” to radiation,wait,Radiation triggers the formation of silver particles which are photon and electron dense,EM autoradiographyprovides the bestresolution,Silver Gra
14、ins corresponding to the approximate position of radio labeled proteins,30 min - 1 hr : ER membrane and lumenradio labeled,another 30 min - 1 hr : Transport / Shuttle Vesicles labeled,another 30 min - 1 hr : Golgi Membrane & Lumenlabeled,another 30 min - 1 hr : Post Golgi Vesicles labeled,another 30
15、 min - 1 hr : Plasma Membrane labeled andsome radio labeled proteins foundin the extracellular space,Palades original data,用酵母突变体研究分泌过程及与分泌相关的基因揭示了小泡运输过程。,用突变体研究内膜系统的运输作用,Mutagenize cells and allow to grow at permissive temp. (24 C). Shift cells to 37 C (non-permissive temp.) for several hours. Sepa
16、rate cells by density gradient centrifugation Plate the dense cells at 24 C. Screen individual colonies for defects in secretion,*permissive vs nonpermissive temperature,sec 突变体的5种不同种类,sec4-2 25 C,sec15-1 after 2 hr 37 C,Wild type morphology,Accumulation of vesicles,3. 膜结合细胞器与内膜系统, 膜结合细胞器(membrane-b
17、ound organelles)或膜结合区室(membrane-bound compartments) 细胞质膜系统(cytoplasmic membrane system) 内膜系统(endomembrane systems),膜结合细胞器的种类和功能,真核细胞膜结合区室的主要功能,膜结合细胞器在细胞内的分布,内膜系统的动态性质,主要是由细胞中三种不同的生化活动引起的: 蛋白质和脂的合成活动: 在动物细胞中主要涉及分泌性蛋白的合成和脂的合成和加工。脂的合成在光面内质网,而分泌蛋白的合成起始于粗面内质网,完成于高尔基体。 分泌活动: 内吞活动(endocytosis pathway),是分泌的
18、相反过程, 细胞将细胞外的物质吞进内体和溶酶体。,内膜系统与蛋白质分选(protein sorting),蛋白质分选定位的时空概念 时间上蛋白质的合成分选有两种情况:先合成,再分选; 一边合成一边分选。为了适于蛋白质分选的时间上的需要,核糖体在合成蛋白质时就有两种存在状态:游离的或与内质网结合的。 空间上包括了细胞内各个部分,蛋白质合成机器的线粒体和叶绿体也需要从细胞质中获取所需蛋白质。,蛋白质分选定位的空间障碍及运输方式,蛋白质定位的细胞内空间部位结构,可分为三种类型: 没有膜障碍的,如胞质溶胶,包括胞质溶胶中的细胞骨架蛋白和各种酶及蛋白分子； 有完全封闭的膜障碍,如线粒体、叶绿体、内质网、
19、 高尔基体等； 有膜障碍,但是膜上有孔,如细胞核。,核孔运输 (transport through nuclear pore) 跨膜运输 (across membrane transport) 小泡运输 (transport by vesicles),一、 内质网的形态结构与功能,（一）内质网的两种基本类型 粗面内质网（rough endoplasmic reticulum，rER） 光面内质网（smooth endoplasmic reticulum，sER） 微粒体（microsome）,内质网(Endoplasmic eticulum,ER):由封闭的管状或扁平囊状膜系统及其包被的腔形成
20、相互沟通的三维网络结构。,粗面内质网（rough endoplasmic reticulum，rER） 多呈扁囊状,排列较整齐，内质网与核糖体共同 形成的复合机能结构,主要功能：合成分泌性蛋白和多种膜蛋白分泌细胞和分泌抗体的浆细胞中的rRE非常发达，未分化的细胞与肿瘤细胞中较为稀少移位子（translocon）:新合成多肽进入内质网有关（Sec61p）有20余种与光面内质网不同的蛋白质；,光面内质网（smooth endoplasmic reticulum，sER）呈分支管状或小泡状，无核糖体附着。脂质合成的场所细胞不含纯粹的RER或SER，它们分别是ER连 续结构的一部分。与高尔基体结构、功
21、能与发生上的关系密切驱动蛋白与内质网结合肌肉细胞中的肌质网是一种特化的SER，称为肌质网，可贮存Ca2+，引起肌肉收缩。,内质网的化学组成:主要化学成份是蛋白质和脂,与线粒体外膜相似 1.脂类：磷脂占50%-60%,还有中性脂肪酸、磷脂酰肌醇、缩醛磷脂、神经节苷脂。 2.蛋白质:周边蛋白、整合蛋白含有30-40种酶NADH-细胞色素P450还原酶、NADH-细胞色素B5还原酶、NADH-细胞色素C还原酶、ATP酶、5核苷酸酶、核苷焦磷酸酶、细胞色素b5、细胞色素P450、核苷二磷酸酶、-葡萄糖醛酸苷酶、酯酶以及合成甘油、脂酸、 胆固醇的酶。,信号识别颗粒受体(signal recognitio
22、n particle receptor) 网质蛋白(reticulo-plasmin)：存在于内质网腔中。内质蛋白(endoplasmin)、钙网蛋白(calreticulin)免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein, BiP)、蛋白质二硫化物异构酶(protein disulphide isomerase,PDI),内质蛋白：二聚体糖蛋白，可能与结合钙有关BiP: 单体非糖蛋白与HSP70同源，分子伴侣PDI：几种存在形式，右催化蛋白质中二硫键的交换，保证蛋白质的正确折叠。 钙网蛋白：可结合大量的钙，含有两个钙结合位点,3
23、.电子传递链两种黄素蛋白NADH-细胞色素C还原酶、 NADH-细胞色素B5还原酶两种血红蛋白细胞色素b5细胞色素P450 4.标志酶内质网的标志酶是葡萄糖-6-磷酸酶。,（二）ER的功能, rER的功能 sER的功能,ER是细胞内蛋白质与脂类合成的基地，几乎全部脂类和多种重要蛋白都是在内质网合成的。,rER的功能,主要功能是帮助膜结合核糖体合成的蛋白质转运。膜结合核糖体上合成的蛋白质与游离核糖体上合成的蛋白质去向是不同的。 蛋白质合成 蛋白质的修饰与加工 新生肽的折叠与组装, 蛋白质合成,内质网上合成的蛋白质主要有： 向细胞外分泌的蛋白、如抗体、激素； 膜整合蛋白,并且决定膜蛋白在膜中的排列
24、方式； 构成内膜系统细胞器中 需要与其它细胞组合严格分开的酶,如溶酶体的各种水解酶； 需要进行修饰的蛋白,如糖蛋白。糙面内质网上核糖体合成的蛋白类型：跨膜蛋白(transmembrane protein)可溶性蛋白 注意：细胞中蛋白质都是在核糖体上合成的，都是起始于细胞质基质中“游离”核糖体。,蛋白质转入内质网合成至少涉及5种成分 信号肽(signal peptide),是引导新合成肽链转移到内 质网上的一段多肽,位于新合成肽链的N端,一般1630个氨基酸残基,含有6-15个带正电荷的非极性氨基酸,由于信号肽又是引导肽链进入内质网腔的一段序列,又称开始转移序列(start transfer s
25、equence)。 信号识别颗粒(signal recognition particle,SRP),由6种结构不同的多肽组成,结合一个7S RNA,分子量325KD,属于一种核糖核蛋白(ribonucleoprotein)。SRP与信号序列结合,导致蛋白质合成暂停。,SRP受体(SPR receptor),是膜的整合蛋白,为异二聚体蛋白,存在于内质网上,可与SRP特异结合。 停止转移序列(stop transfer sequence),肽链上的一段特殊序列,与内质网膜的亲合力很高,能阻止肽链继续进入内质网腔,使其成为跨膜蛋白质。 转位因子(translocator),由3-4个Sec61蛋白复
26、合体构成的一个类似炸面圈的结构,每个Sec61蛋白由三条肽链组成。,可溶性蛋白质转入内质网合成的过程：翻译进行到50-70个氨基酸残基，信号肽与SRP结合肽链延伸终止SRP与受体结合SRP脱离信号肽肽链在内质网上继续合成，同时信号肽引导新生肽链进入内质网腔信号肽切除肽链延伸至终止翻译体系解散。,sER的功能,光面内质网具有很多重要的功能,如类固醇激素的合成、肝细胞的脱毒作用、糖原分解释放葡萄糖、肌肉收缩的调节等 合成脂类 类固醇激素的合成(生殖腺内分泌细胞和肾上腺皮质) 肝的解毒作用（Detoxification）System of oxygenases-cytochrome p450 fam
27、ily 肝细胞葡萄糖的释放（G-6PG） 储存钙离子：肌质网膜上的Ca2+-ATP酶将细胞质基质中Ca2+ 泵入肌质网腔中 。,磷脂的合成过程：在光面内质网上合成的磷脂先作为内质网膜的构成部分,然后再转运给其他的膜。 内质网膜中脂肪酸与胞质溶胶中的磷酸甘油结合,然后脱磷, 并内质网膜中胆碱磷脂转移酶的作用下,将胞质溶胶中的CDP-胆碱与内质网膜中的甘油脂肪酸结合形成磷脂酰胆碱。 新合成的磷脂酰胆碱朝向胞质溶胶一侧,但可在内质网膜中磷脂转位酶的作用下翻转到内质网的腔面。,翻转酶催化的磷脂移动也是有选择性的,如能够翻转磷脂酰胆碱的翻转酶则不能催化其他的磷脂翻转, 这样保证了膜中磷脂分布的不对称。
28、磷脂的转运有两种方式。一种是凭借一种水溶性蛋白,叫磷脂交换蛋白的作用:另一种是以出芽的方式转运到高尔基体、溶酶体和细胞质膜上。, 蛋白质的修饰与加工,修饰加工：糖基化、羟基化、酰基化、二硫键形成等 糖基化 发生在ER腔面,随着多肽合成同时进行，最常见的蛋白质修饰，寡糖链连接在插入膜内的磷酸多萜醇上，当糖基化有关的氨基酸出现后，glycosyltransferase 作用下，将寡糖基由磷酸多萜醇转移到相应的天冬酰胺残基上。 N- linked glycosylation（Asn）O-linked glycosylation（Ser/Thr or Hylys/Hypro）O-连接的糖基化主要发生在
29、高尔基体中 酰基化发生在ER的细胞质基质侧：软脂酸共价结合在跨膜蛋白的Cys残基上。, 新生肽的折叠与组装,内质网腔是非还原性的环境，易于二硫键形成，对肽链的正确折叠带来很大困难； 正确折叠涉及驻留蛋白：具有4肽信号KDEL or HDEL蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI),附着在内质网膜腔上,切断二硫键，帮助新合成的蛋白重新形成二硫键并处于正确折叠的状态 结合蛋白(Binding protein,Bip,chaperone):具有4肽信号KDEL or HDEL识别错误折叠的蛋白或未装配好的蛋白亚单位，并促进 重新折叠与装配。 4肽信号KDEL
30、orHDEL,保证PDI和Bip滞留在内质网中,维持高浓度。,ER合成细胞所需绝大多数膜脂(包括磷脂和胆固醇)。两种例外：鞘磷脂和糖脂(ER开始Golgi complex完成）；Mit/Chl某些单一脂类是在它们的膜上合成的 各种不同的细胞器具有明显不同的脂类组成： phosphatidylcholine(PC):ERGCPM(高低)phosphatidylserine(PS)：PMGCER(高低) phospholipd translocator / flippase与膜质转位 磷脂合成酶是ER膜整合蛋白，活性位点朝向cytosol；磷脂的转运:transport by budding：ERGC、Ly、PM transport by phospholipid exchange proteins（PEP):ERother organelles（including Mit and Chl）。,三、内质网与基因表达的调控,内质网蛋白质的合成、加工、折叠、组装、转运及向高尔基体转运的复杂过程显然是需要有一个精确调控的过程。影响内质网细胞核信号转导的三种因素： 内质网腔内未折叠蛋白的超量积累。 折叠好的膜蛋白的超量积累。 内质网膜上膜脂成份的变化主要是固醇缺乏不同的信号转导途径，最终调节细胞核内特异基因表达。,
