1、Chapter 5 植物组织器官培养,植物组织器官培养：是以组织、器官作为外植体进行的离体培养，包括离体的根、茎、叶、花器和果实以及各种组织的培养。,器官培养（Organ culture ）,植物某一器官的全部或部分或器官原基的离体培养，包括根、茎、叶、花、果实、种子等。 特点：能保持器官所具有的特征性结构。,指形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官组织以及愈伤组织的培养。,组织培养（Tissue culture）,组织器官培养不仅是研究组织器官生长、营养代谢、生理生化、组织分化和形态建成的最好的材料和方法，而且在实践上具有重要的应用价值。,一、器官形成,（一）愈伤组织诱导在人工控
2、制条件下，把从植物体上分割下来的一个细胞、一种组织或一个器官置于适宜的营养和环境条件下，使之持续生长分化并发育成完整的再生植株，愈伤组织的出现是一个重要过程。,1.愈伤组织形成特点,（1）启动期：成熟组织在各种刺激因素的诱导作用下细胞内蛋白质及核酸的合成代谢迅速加强的过程。（2）分裂期：细胞经过诱导期的准备后，进行细胞数目的增殖。（3）分化期：停止分裂的细胞发生代谢方面的变化，出现了形态和生理功能上的分化。,从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：起动期 （诱导期）、分裂期和分化期。 三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明显的差别。,Stage 1. Induction
3、（诱导期）: 诱导期是细胞准备分裂的时期，是愈伤组织形成起点。外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程而逐渐停止分裂，开始执行它们各自不同的功能。外植体细胞一般处于静止状态，称为静止细胞。 特点：在诱导期，代谢活化了，细胞内 的合成代谢迅速进行，但是细胞 的大小仍然和外植体时一样， 没有多大改变。,From most kinds of plants callus can be established relatively easy; in dicots, monocots, gymnosperms (裸子植物), ferns (蕨类) and mosses(苔藓). Tissues from
4、many organs may have the potential to divide and proliferate on appropriate culture media, however, some tissues are more predisposed to rapid cell division than others.,大多数植物容易产生愈伤， 但许多植物趋向于细胞快速分裂, 诱导期的长短： 由一系列内部（植物的种类、生理状况）和外部（光照、外源激素）因素决定。 例如菊芋的诱导期有时还不需要1天，胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时间的改变，诱导期也发生改变。从11月到次年4月
5、取菊芋块茎进行培养，则诱导期从22小时逐渐延长到40小时。,故可以从内外因两方面着手，改变诱导期长短 主要外因方面是添加一些生长物质 Steward等(1964)用2, 4-D及其类似的生长调节物质处理处于静止状态的组织，看到RNA的含量很快明显地增加。并且2、4-D积累在分裂细胞的核仁中。 Yeoman 和 Mitchell (1970) 指出了核仁是生长物质的作用部位。,Brown（1972）认为静止细胞是具有分裂能力的，只是被存在的一类抑制物质所阻止，而使其分裂能力不能表现，如果除去抑制物质，就可恢复分裂能力。若加入抵消抑制物质影响的外源物质（激素），细胞就立即进行DNA复制，全部细胞进
6、入S期，并发生同步分裂。,Stage 2. Cell division 分裂期,Active cell division, cells revert to a meristematic dedifferentiated state.,分裂期：外植体(explant)中已分化的活细胞在外源激素的作用下，外植体外层细胞出现了分裂，由于外层细胞的迅速分裂使得这些细胞的体积缩小，逐渐回复到分生组织状态，因此也称为回复变化。在回复变化时，细胞通过脱分化的起动期而进入分裂，并开始形成愈伤组织。特征：生理生化上分裂期的一个明显特征是外层细胞进行分裂，而中间的细胞不分裂。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核
7、和核仁增到最大等,愈伤组织的特征细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。,Stage 3. Differentiation 分化期,Appearance of cellular differentiation and the expression of secondary metabolic pathways.,分化期特点：分化结构的形成过程加速，超过了回复变化。外层细胞的分裂逐渐减慢，甚至停止，为次生生长所代替，大量次生结构出现。在这时期中细胞的伸展和分裂处于平衡，故细胞的平均大小往往没有变化。根据形态变化列出三个时期，实际上它们并不是严格的，特别是分裂期和分化期。一块培养组织
8、的细胞既有分裂的又有分化的。,愈伤组织的特点：生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。,Callus types,Callus may be heavily lignified （木质化）and hard in texture, whereas others break easily into small fragments (friable). Different types of Gloriosa callus:,Rhizogenic callus,Callus exuding sticky poly-saccharides,F
9、riable,Hard / lignified callus,根据愈伤质 地划分为：,愈伤组织的质地和物理性状是有明显差异的 有的坚实，有的脆。脆的愈伤组织是悬浮培养生长的最合适的材料，容易使组织处于分散状态。 White(1956)用白云杉愈伤组织做材料，发现坚实的可以产生脆的变异，但无相反情形发生，用高浓度的酵母提取物能诱导豌豆愈伤组织变脆。 Blakely和Steward(1961)指出单冠毛菊脆的和坚实的愈伤组织间是可以相互转变，只要改变椰子汁和萘乙酸的量就能转变类型。 Grant和Fuller(1968)在蚕豆根的愈伤组织中，也见到有脆与坚实的两种类型并可以互变。,愈伤组织的基本解剖
10、学： 基本解剖学特征明显差异。 菜豆，凡是脆的都有大量的分生组织中心或瘤状结构，它们被大而未分化的细胞所分开；而不脆的类型很少分化，而且大部分是高度液泡化细胞。 单冠毛菊，脆的愈伤组织由松散排列的细胞组成，坚实的愈伤组织是由堆得很紧的细胞所组成。,愈伤组织的化学成分： 蚕豆，不脆的愈伤组织有大量的组成细胞壁的多糖，以单位干重计，细胞壁的部分也多；但与果胶物质及半纤维素相比，纤维素的百分率是低的。无疑，大量的纤维素增加了细胞的硬度，而果胶含量的增加，保证了细胞紧紧地粘在一起而不易断碎。,Callus may have a yellow, white, green or red (anthocya
11、nin 花青苷) appearance.,不同颜色的愈伤,2.愈伤组织的生长及分化,旺盛生长的愈伤组织可分为松脆型和坚硬型两类，当培养基中生长素类浓度高时，可使愈伤组织块变松脆；降低或除去生长素，则愈伤组织可以转变为坚实的小块。,3.影响愈伤组织培养的主要因素,（1）外植体 （2）基本培养基 （3）激素组合 通常高浓度的生长素和低浓度的激动素有利于愈伤组织的诱导和增殖，2,4-D是诱导愈伤组织最有效的物质。,植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用。 如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，当6-BA加倍时，茎段的愈伤组织可以再分化出仔球，而6-B
12、A浓度过高(150倍)或过低(10倍)则无仔球形成。,器官分化的植物激素控制理论大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。生长素与细胞分裂素的比例小时则产生苗，比例大时则生根，而两种激素的比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。,愈伤分化,（4）培养条件 光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需光，分化需光。继代培养一般需光。此时光对器官的作用是一种诱导反应。 温度：一般采用2428的恒温条件进行。 湿度：较大，以免引起培养基干缩。,（二）器官分化,1.植物细胞全能性学说每个植物体细胞像胚胎细胞一样，可以经过体外培养成为一个完整植株，因为每个细胞都含有一套完整的基因组，包含全部遗传信息
13、，具有在适宜条件下可以被诱导分化形成一个完整植株的潜力。,2.实现植物细胞全能性的途径,（1）以植物体细胞为材料，可以获得二倍体植株，可以正常开花结实。 （2）以植物性细胞（大、小孢子体）为材料，可以获得单倍体或其他倍性的植株。 （3）以植物单细胞来源的原生质体或已融合的原生质体为材料，可以获得不同倍性的植株，甚至是自然界不存在的远缘杂种。,3.细胞的脱分化 与再分化,植物的细胞、组织及器官由于在生命周期中所处的地位不同，受植物整体的发育调控系统的作用与制约有差异，作为外植体时所表现的分化程度就不同。,要使细胞全能性得以表达，必须使细胞处于分裂状态，并具有再分化的潜力。植物细胞全能性的实现就是
14、从已经脱分化的细胞中分化出组织器官，即在特定的离体培养的条件下经历器官发生过程形成根或芽，或经历胚胎发生过程形成胚状体最后发育为完整植株。,4.器官分化与植株形成,植物离体培养中器官分化有两种情况：一种是直接从外植体细胞上形成器官原基后发育成器官；另一种是先形成愈伤组织后形成不同的器官原基。,（三）外植体的器官发生途径,外植体在完成脱分化过程后，以何种方式进入器官发生途径，对于离体培养快速繁殖是一个重要问题。由于植物种类不同，采用的外植体类型不同及培养条件的差异，器官发生的途径也不同。,1.腋芽萌发,繁殖系数首先取决于侧芽原基的数目，再就是培养基诱导侧芽萌发的能力及继代培养的次数。外植体的侧芽
15、萌发途径材料的变异率较小，在优良品种快速繁殖中起着重要作用。,2.不定芽发生,在培养的外植体上可在芽原基及分生组织处形成大量不定芽，直接萌发成苗。直接不定芽发生：指不经过愈伤组织阶段，直接从外植体上产生不定芽。间接不定芽发生：外植体先脱分化产生愈伤组织，再分化形成芽器官。,3.体细胞胚胎发生,外植体经过胚性细胞的分化，可直接形成胚状体。,（四）影响器官分化的因素,1.培养基成分,（1）激素激动素导致芽的分化和发育，生长素类抑制芽的形成。相对高浓度的IAA有利于细胞增殖和根的分化，相对高浓度的腺嘌呤或激动素促进芽的分化，激动素/生长素比例控制器官分化模式。,（2）矿质元素及其他有机成分各种矿质元
16、素可以促进植物组织培养中的器官发生。糖类除了维持培养基的渗透压外，还是重要的碳源和能源，个别情况下糖的平衡可以逆转激素作用的比例。天然复合物可以提高培养效果。,2.环境条件,（1）光照 （2）温度 接近于植物原产地的生长温度对培养物更有利。在诱导形成愈伤组织时昼夜恒温较好，昼夜有一定的温差有利于器官分化。 （3）湿度,3.植株材料,（1）品种基因型的差异 （2）材料生理状况 幼年性强的实生苗比成年植株对培养的反应要好。 （3）不同的器官分化类型,（五）试管苗的驯化,1.培育壮苗 2.选择合适的移栽介质 3.注意移栽方式 4.加强栽后的环境调控,二、体细胞胚胎发生,（一）概念与特点,体细胞胚胎的
17、概念胚胎：自然状态下，高等植物的胚胎是受精作用后由雌雄配子结合而成的合子发育而来的，称为合子胚。 1、合子胚（生命周期） 2、非合子胚i、无融合生殖胚ii、体细胞胚（组培周期）,反足细胞,极核,助细胞,卵细胞,子叶,胚芽,胚柄,胚根,含成熟胚的种子,再生植株,返回,合子,原胚,顶细胞,基细胞,球形期,心形期,鱼雷形期,子叶期,不对等 分裂,无融合生殖胚：a、孤雌生殖：未受精卵细胞 胚（n）b、无配子生殖：反足细胞（n）助细胞（n） 不定胚珠心细胞 （2n）返回,体细胞胚（组培周期）：体细胞 愈伤组织 原胚 离体生殖细胞 （含有EC）成熟胚再生植株,返回,1、概念： 体细胞胚：在组培条件下，起源
18、于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育而产生的胚状结构，又称胚状体。理解：i、组培途径；ii、源于非合子细胞，不同于合子胚与无融合生殖胚；iii、经历胚胎发育，不同于器官发生过程；,2.特点,（1）具有明显的两极性 （2）遗传的稳定性 （3）发生数量大，增殖率高,（二）体细胞胚发生的途径及类型,1.体细胞胚发生的途径,直接途径（少数） ：从外植体某个部位直接诱导分化出体细胞胚。 explant EC 原胚 成熟胚（无callus出现） eg：石龙芮、烟草、胡萝卜、蓝猪草、菊苣 大叶落地生根 等等 。,间接途径（多数） ：培养的材料在培养条件下，首先产生愈伤组织，然后在愈伤组织表面分化形成体细
19、胞胚。explant callus（含EC） 原胚 成熟胚,2.体细胞胚发生的类型,体细胞胚的类型：i、体细胞胚（2n）；ii、生殖细胞胚（n）,如：花粉胚,（三）体细胞胚发生的机制,植物体细胞胚胎发生就是已经分化的植物体细胞经过激素诱导脱分化，再经过胚性细胞分化过程，形成外部形态和内部机制均已完善的胚状体的过程。脱分化的植物体细胞分化为胚性细胞是受细胞内外多种因子所调控的，其作用的终点是调控特定基因的有序表达，完成体细胞胚的分化和发育。,（四）影响体细胞胚胎发生的因素,体细胞胚胎发生是一个系统和过程，是一个多种因素综合作用的结果，其影响因素很多。,1.极性和生理隔离,双极性（double p
20、olarity）：指在细胞发育的初期其内含物的分布具不均匀性，形成胚性细胞后具有发育成芽端和根端的潜在能力。生理隔离（physiological isolation）：指体细胞胚与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，胚状体与周围组织间形成缝隙，处于较独立的状态。,2.外植体的遗传背景,不同植物的基因型不同，在培养条件下形成体细胞胚的反应各异。同一物种的不同类型、品种发生体细胞胚的难易程度也不同。,3.外植体的生理年龄等,植物材料的幼嫩程度对培养的反应差别较大，幼年的细胞易于接受培养因子的启动。,4.植物激素,生长素是诱导体细胞胚的重要激素。 （1）生长素： 过程：增殖培养与成胚培养两个阶段
21、i、增殖培养：（诱导）a、使用含生长素的培养基，多用2,4-D;（单：2-8mg/L 双：0.5-1mg/L）b、callus建立，含有EC 继代，EC ii、成胚培养：（分化）a、去（降）生长素培养基;b、EC 成熟胚,模式：explanti、增殖基（有2,4-D）callus建立与增殖 EC增多 ii、成胚基（去2,4-D）胚状体,原因：2,4-D可以诱导内源乙烯（Eth）产生 内源Eth不影响EC增殖，但抑制EC进一步分 化成胚。2,4-D 去2,4-D Explant EC 成熟胚,Callus建立与 增殖，含有EC,但不能成胚,解除成胚抑制,（2）其它激素： CYT：多用于单子叶植物
22、与2,4-D结合起到更好的诱导效果。N6 /MS +CYTa+2,4-Db (单)MS+2,4-Dc (双) 细胞分裂素诱导蛋白质的合成，促进mRNA合成和多核糖体的形成与活化。 GA3、ABA抑制成胚；,脱落酸对植物体细胞胚的发生具有重要作用。 乙烯是促进成熟和衰老的激素，抑制体细胞胚的发生。 其他（油菜素甾体类、多胺类及茉莉酸类）具有激素活性的物质,5.矿质元素,金属离子在诱导体细胞胚中有重要作用，不仅可以提高诱导频率，还可以加速胚性愈伤组织的形成。培养基中添加适量的微量元素或稀土元素，可以提高体细胞胚的诱导频率，促进胚性细胞的分化与发育。,6.有机化合物等,适宜的糖浓度可以保障细胞生长的
23、渗透势，保证了较高的诱导频率。培养基中氮的形式对胚胎发生有重大影响，无机态的NH4+和NO3-中，以前者有利于胚胎发生，有机态氮以各种氨基酸的复合物应用较多。环境条件也会影响胚状体的发生。,三、离体根的培养,（一）离体根培养的意义,1.是进行根系生理和代谢研究的最优良的实验体系。 2.是研究器官分化形态建成的良好体系，以证实根细胞的全能性。,3.建立快速生长的根无性系，对生产重要药物有重要意义。 4.根细胞培养物诱变处理可筛选出突变体而应用于育种。,（二）培养技术,1.培养方式,固体培养法 液体培养法 固体液体培养法：根基部插入固体培养基中，根尖浸在液体培养基中。,2.培养基,离体根培养采用无
24、机离子浓度低的培养基，例如white和1/2MS和1/2B5或2/3MS和2/3B5培养基。,3.根无性繁殖系的建立,番茄根的培养过程 番茄种子常规表面消毒，在无菌条件下，在培养基上萌发。 胚根长至30-40mm后，从根尖一端切取10mm长接种于固体培养基中。 暗条件下培养4天有侧根发生，7天后又可以切下侧根的根尖作为新的培养材料再进行扩大培养。 由单个直根衍生，并经继代培养而保持遗传性一致的根的培养物，称为离体根的无性系。,4.植株再生培养,在脱分化培养基上诱导形成愈伤组织；在再分化培养基上诱导芽的分化。,（三）离体根生长的营养要求,1.无机成分：要求全部必要元素。 碘有利于番茄根的生长。
25、硼对离体根的生长也具有重要的影响，缺硼会降低根尖细胞的分裂速度，阻碍细胞伸长等。 2.氮源：铵态氮、硝态氮和可溶性有机氮，以硝态氮效果最好。 3.碳源:蔗糖效果最佳。,4.维生素：硫胺素(维生素B1)和吡哆醇(维生素B6)对离体根培养的作用明显。 5.生长物质：对离体根的生长而言，生长素的效果最明显。 生长素对不同植物的根离体培养三种反应： 生长素促进离体根的生长(如玉米、小麦等)； 离体根的生长依赖于生长素的作用(如黑麦)； 生长素抑制离体根的生长（樱桃，番茄）。,有些植物的根，能高速生长并产生大量强壮的侧根，可继代培养而无限生长。 有些植物的根，能较长时间的培养，但不是无限的。 有些植物的
26、根却很难生长。,四、离体叶培养,离体叶培养：指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。,很多植物（非洲紫罗兰、香叶、天竺葵、秋海棠等）的叶片具有很强的再生能力，由于取材方便，数量多且均一性较强，可以作为适宜的外植体。,基本培养过程,取叶片 表面消毒 平放在固体培养基上培养 大多植物的叶组织在离体培养条件下先形成愈伤组织，再分化出胚状体、茎、叶和根。 1.将叶表面洗干净，70乙醇浸泡30秒表面消毒，用0.1升汞浸泡数分钟。 2.叶片在培养基上的生长状况大多依赖于离体时的成熟程度，幼叶比近成熟的叶生长潜力大。,叶片诱导丛生芽生根培养移栽。 非洲紫罗兰嫩叶，70酒精略蘸一下，再0.
27、1升汞溶液消毒5-8 min，无菌水冲洗数次，切成0.5-1 cm的小块接种于 MS + 1 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA 光照条件下培养，35天后叶片直接分化出丛生芽。 小丛生芽转接于1/2 MS + 0.2 mg/L IBA的培养基上，10天后，主茎叶片明显增大，诱导根分化，接种15天后即可移栽。,举例：非洲紫罗兰嫩叶离体培养的过程,五、花器官和 种子培养,（一）培养方法1.花器官培养花器官培养：指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。,1）花器培养的意义,（1）用于花的性别决定研究； （2）用于果实和种子发育研究； （3）用于形态发生的
28、研究； （4）用于试管苗的生产，加速扩大珍贵品种的种植。,2）培养方法,（1）取材 （2）接种培养,2.种子培养,种子培养：指受精后发育完全的成熟种子和发育不全的未成熟种子的无菌培养。,1）应用价值,（1）可以打破种子休眠，大大缩短开花周期。 （2）是大量生产试管苗的好材料，具有植株分化容易，无菌操作方便等优点。 （3）可使远源杂交产生的杂种败育种子，正常萌发产生第二代植株，缩短育种周期，提高杂种种子的萌发率。,2）培养技术,（1）种子灭菌 （2）培养基 （3）接种培养,六、人工种子,人工种子,人工胚乳,人工种皮,胚状体,（一）人工种子的概念,人工种子（artificial seed）：指通过
29、植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面还被有特定物质，在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体。,1978年Murashige首次提出人工种子的设想。设想人工种子最外层为有机的薄膜包裹，起防止水分散失及保护作用，其中含有培养物所需的营养成分和某些植物激素，以作为植物材料萌发时的刺激因素并提供能量，最里面就是被包埋的胚状体或芽体等植物材料。,（二）人工种子的意义,1.通过植物组织培养技术生产的胚状体具有数量多，繁殖速度快，结构完整等特点，可在短期内大量生产优良种苗。 2.由无性生殖方式产生的体细胞胚可以固定F1代杂种优势，故可以大量生产F1代杂种种子。 3.为一些不能采用种子繁殖的园艺植
30、物开辟了良种繁育的新途径。,（三）人工种子的制作程序,a.体细胞胚的诱导及同步化控制；b.人造胚乳及人造种皮研制及包埋；c.人工种子的贮存及萌发。,1.高质量体细胞胚发生系统的建立,所谓高质量体细胞胚，指的是体细胞胚具有发育成完整小植株的能力，这就要求体细胞胚在解剖构造上具有明显的胚根、胚芽的双极性结构，这是人工种子制作能否成功的关键。,2.体细胞胚胎发生的同步化控制,（1）化学抑制法 （2）低温抑制法 （3）渗透压选择法 （4）机械过筛选择法 （5）应用植物胚性细胞分级仪,3.人造种皮及人造胚乳研制及包埋,在获得形态一致、发育正常的胚状体后，参照天然种子的结构，制作人工种子需要考虑人造种皮及
31、人造胚乳研制及包埋技术。,（1）人造种皮的研制,能保持胚状体的活力，有利于萌发或贮存。因此，所选的材料要有韧性，耐压，对胚状体无毒害作用，含有胚状体发芽生长所需要的营养成分及植物激素，还应含有杀菌剂以防止播种后土壤微生物的侵染。,（2）人造胚乳的研制,人造胚乳即包裹胚状体的营养基质，提供胚状体发芽需要的营养物质。人工胚乳的主要成分为无机盐、碳水化合物及蛋白质等营养物质。通常是把各种营养成分配合成培养基（胶体），其中还可以加入抗生素、防腐剂或农药作成微胶囊。,（3）人造种子的包埋技术,最佳的凝胶包埋材料是澡酸盐，包埋方法有滴注法和装模法。,4.人工种子的转换,转换（transformation）
32、是指由体细胞胚发育成具有正常表现型的绿色植株的能力。转换率的百分数，用来表示不同发育阶段的体细胞胚其发育为小植株的比率。,（四）人工种子的应用前景,人工种子的产生是对植物传统繁育方式的革命，前景乐观。,思考题,根的培养基本过程 叶的培养基本过程 人工种子的应用前景,Chapter 6 离体茎培养,离体茎培养：是指从几微米到几十微米的茎分生组织、几十毫米的茎尖或更大的芽、幼嫩的茎段和小块块茎的无菌培养。,类型,茎尖培养： 茎段培养：,10-100m的茎尖分生组织（脱毒）,带有腋(侧)芽或叶柄、长几厘米的茎节段进行离体培养（快繁）,第一节 茎尖培养,一、植物病毒的危害草莓病毒：产量严重降低，品质大
33、大退化葡萄扇叶病毒：葡萄减产l0%-18%，马铃薯病毒：大约有几十种，严重影响生产花卉病毒：影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系。美国用组织培养法，使苹果无病毒苗已工厂化育苗，并在各国普遍开展。,1、植物病毒的危害：一旦染毒，终生带毒；难用药剂控制；通过嫁接或虫媒传播，随着无性繁殖系数增大而传播加快；严重影响作物产量与产品质量；（尤其是一些潜隐性病毒危害更大） 如：苹果锈果病、花叶病，香蕉束顶病，草莓斑驳病，马铃薯卷叶病，枣疯病 etc.,2、防治策略：使用无毒种苗严格检疫清除传毒源防治传播虫媒3、获得无病毒繁殖体的方法：引进无毒种苗
34、；筛选无毒个体；脱毒（去毒） 培育无毒株,无毒株：通常无毒株指的是不带特定某种或几种病毒的植株，工作中不存在完全无毒这一概念。病毒的交叉保护现象：当植株已经被病毒感之后，其它病毒对植株的侵染就比较困难。工作中可以利用此现象使植株获得抗毒性能，从而缓解一些高危害病毒的危害。,二、脱毒的概念及方法：脱毒：用人为的方法将植物体内的病毒去掉的一种方法。方法：1、热处理法；2、茎尖培养法；3、其他途径脱毒,1热处理法的发现及应用热处理又称温治疗法(theomtherapy)，原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，在高温下，不能生成或生成病毒很少，而破坏却日趋严
35、重，以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目的。,原理：病毒是蛋白质外壳包被的核酸分子，热处理能使病毒在体内的增殖减缓或停止，因而失去侵染能力热处理能刺激细胞分裂，使植物细胞在与病毒的生存竞争中占优势；方法：愈伤组织热处理；（不常用）植株热处理；,(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室(箱)内，一般在3540。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。,评价：利用了病毒的热敏性i、并非
36、所有病毒都有热敏性；ii、热处理影响存活率；,无损伤,病毒被杀死,寄主被杀死,低温,高温,2.茎尖培养脱毒：目前唯一行之有效的脱毒方法。1952 法 Morel 大丽花脱毒苗,3.其他途径脱毒 （1）愈伤组织培养脱毒通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。 （2）茎尖微体嫁接木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.41.0mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有
37、：8氮鸟嘌呤、2硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。例如，将100g 2硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。,三、茎尖培养,1茎尖培养脱毒原理：病毒侵染植物后，通过胞间连丝转移到其他细胞中，或依靠筛管进行转移。因此，病毒在患病植株上的分布是不均匀的，即老的成熟器官中病毒含量高，幼嫩未成熟的器官中病毒含量低，而茎尖分生组织在细胞没有充分分化之前不受侵染，故几乎不带病毒。植物的种子一般是无毒的遗传性状不够稳定，易失去F1代杂种优势，不利于成年型的保持，繁育周期较长。,2、茎尖培养脱毒方法：茎尖 丛生芽 生根 再生株 （无毒） （无毒）i、茎尖培养：,大茎尖,小
38、茎尖,叶原基,顶端分生组织,大茎尖较大，可能带病毒；小茎尖大小0.1mm，一般无毒或特定无毒。大 脱毒效果差，成苗易 茎尖小 脱毒效果好，成苗难 在满足培养材料成苗的前提下，茎尖越小越好。 ii、顶端分生组织培养（不带叶原基）,3、评价：i、行之有效的脱毒方法，与热处理结合效果更佳;ii、对难再生的植物，可结合微体嫁接等方法获得无毒种苗；茎尖实生苗砧木,4、培养技术,（1）茎尖组织的分离,从未发病植株上，取正在生长的顶芽、萌发芽和球茎的中心芽，酒精浸没几秒到几十秒，用次氯酸钠灭菌后，用无菌水冲洗。在无菌条件下把芽放在解剖镜下进行分离，逐层把芽外面的幼叶和叶原基除去，保留含有12个叶原基的0.1
39、0.2长的生长点。,（2）培养,对于芽的发育，往往以较低浓度无机离子为有利，故常用培养基有White、Morel、Kassanis等。2,4-D、IAA、NAA等生长素是必需的，但浓度不能太高，一般用0.1mg/L左右即可。,（3）脱毒试管植物的移植,嫁接扦插法：把试管苗剪下，先嫁接在砧木上，然后再扦插成活。移植法：把试管苗直接移到消毒过的土壤中，育成植株。,四、无病毒植株的鉴定,1、检定方法： 检查植株有无病毒病的症状；指示植物法血清法（生理、生化指标）电镜检测酶联免疫鉴定法（ ELISA ）,2、检定工作贯穿无毒种苗繁育的整个过程中脱毒培养的植物是否确认为特定无毒；扩繁原种是否重新染毒；,
40、（一）指示植物(indmatingplant)法利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法，就是枯斑测定法。这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。最早是美国的病毒学家Holmes 1929年发现的。他用感染TMV的普通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合，然后在烟叶子上摩擦,2-3d后叶片止出现了局部坏死斑。在一定范围内，枯斑与侵染性病毒的浓度成正比。条件简单，操作方便，经济有效枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度，只能测出病毒的相对感染力。,由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择的指示植物不但一年四季
41、都容易栽培，并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，而且在较广的范围内具有同样的反应。指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环状病斑构成。 木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁接接种的方法。植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。,（二）抗血清(antisemm)鉴定法用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，这种方法特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方
42、法之一。,（三）电子显微镜(elecmc microscope)检查法由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒，而借助于普通光学显微镜也只能看到小至200bm的微粒，所以只有通过电子显微镜才能分辨0.5m大小的病毒颗粒。这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类，是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。优点：灵敏度高能在植物粗提取液中定量测定病毒。,（四）酶联免疫鉴定法(Enzyme linked immunity absorption assay ELISA)酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支
43、持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。,五、无病毒植株的繁殖,选未发病的优良母株 分离不带病毒的分生组织 无菌培养茎尖分生组织 培养成完整植株 建立无性繁殖系, 种性鉴定 保种 病毒鉴定 无病毒原种生产 原种生产 扩大繁殖生产种商品种,六、无病毒植物的利用,1、无病毒苗的保存繁殖无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好地隔离与保存。 2、无病毒苗的利用生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此
44、种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染。一旦感染，便会影响产量和质量的保证。因此，应重新采用无病毒苗，以保证生产的质量。,3、无病毒苗的效果无病毒苗可以表现出明显的优良效果。如草莓可增产20%50%，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重等特点。,七、影响茎尖培养和脱毒的关键因素,1、接种体的大小对培养而言，接种茎尖越大，越易培养成功，越小则越难成功；对脱毒而言，茎尖越大，茎尖中病毒原浓度越高，就越难获得脱毒植株，而茎尖越小，得到无病毒植株的可能性越大。,2、生
45、长激素的浓度,生长激素既是诱导茎尖生长的重要因素，又是诱发茎尖细胞变异的因素。因此要选择合适的生长激素浓度，既能保证茎尖的正常生长，又不会引起茎尖细胞的变异。,培养过程中茎尖生长的类型,生长太慢型：接种后茎尖基本上不增大，只是茎尖逐渐变绿，出现绿色小点，细胞逐渐老化而进入休眠状态，或者逐渐变褐死亡。 原因：首先生长素浓度太低；其次培养温度过高或过低。,生长太快型：接种后茎尖迅速增大，往往在茎尖基部产生愈伤组织，并迅速增殖，而茎尖不伸长。久之茎尖处也形成愈伤组织，从而丧失发育成苗的能力。 原因：首先生长素浓度太高，引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织形成；其次光照太弱和温度太高。,生长正常型：接种后茎
46、尖基部稍增大并形成少量愈伤组织。茎尖颜色逐渐变绿，并逐渐伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成带正常叶的苗。 原因：激素供给适当，其他如光照和营养也较合适。,茎尖生长所需的激素,生长素类：如2,4-D，IAA，NAA，浓度范围为0.11mg/L。细胞分裂素类：如6-BA，KIN和ZEA，浓度范围为0.050.1mg/L。赤霉素类：有利于茎尖的伸长和成活，一般0.1mg/L。,思考题： 1、为什么对脱毒处理后产生的植株必须进行病毒鉴定?为什么已通过病毒(特定病毒)鉴定的无病毒苗还须重复鉴定? 2、某地区的一种马铃薯经多年的种植后，植株变的矮小，产量和品质都下降，怀疑是由病毒所至。请你设计一个病毒
47、的鉴定和脱毒的技术方案。,第二节 茎段培养,茎段培养：指不带芽和带1个以上定芽或不定芽的，包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段的无菌培养。,嫩茎段常作为快速繁殖的外植体：即当年萌发或新抽出的尚未完全木质化的枝条，其细胞的可塑性大，容易离体培养。,1.概念,2.作用,无性系快速繁殖； 探讨细胞的分裂潜力和全能性； 诱发细胞变异，筛选突变体 理论基础研究。,3.茎段培养的优点,技术简单易行，繁殖速度快； 加速良种和珍贵植物的繁殖，以芽生芽的方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一； 解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖，且可节省种株； 试管苗便于运输和防止种苗带菌传播，有利于国际种质交流； 试管
48、苗可用于保存某些难以用种子保存的种质资源。,4、建立无菌材料（茎段）及培养,将经过表面消毒的茎段在无菌条件下，切成几厘米长带节的节段，接种在固体培养基上。经过培养后，在茎段可直接发生不定芽，或先诱导形成愈伤组织，再脱分化形成再生苗。把再生苗进行切割，转接到生根培养基上培养，便可得到完整的小植株。,图示茎段培养过程,去叶片用自来水冲洗,5、茎的培养发育方向,腋芽萌发 脱分化后产生胚状体（原球茎） 脱分化后直接产生不定器官,脱分化后形成愈伤组织,蝴蝶兰腋芽萌发,（1）无菌苗的建立,可产生单生芽、丛生芽和形成完整植株，我们希望属于一、二种。,材料的选择 和处理,选幼嫩茎段或鳞茎，剪除叶片，用肥皂水擦
49、洗干净，无菌条件下灭菌处理，以备接种。,接种,在无菌条件下，用无菌的小刀，将茎段切成0.510的带节切段；若是鳞茎则切取带小段鳞片的底盘，在切开底盘，使每块底盘上都带有腋芽，然后接种到培养基上。,培养,25左右温度，充分的光照和光周期。基部切口出现愈伤组织，呈现稍许增大，芽开始生长，有时出现丛生芽，得到无菌苗。,培养成功的关键,a.取材：取生长健壮，无病虫，正在生长的幼嫩茎段进行培养。茎的基部比顶部切段，侧芽比顶芽的成活率低。休眠期取材成活率低于生长期。,b.生长激素,细胞分裂素是必需的，大部分茎段培养中都使用了外源细胞分裂素。通用的有6-BA，KIN和zip。生长素不是必需的，因为芽中可以合成。GA对有些植物的芽生长是有益的，但大多数外植体可以合成足够的GA。,
