1、实验2 分光光度计线性分辨范围的测定 一、实验目的,(1)掌握分光光度法的用途、原理、测定分光光度计线性范围 。(2)了解使用紫外可见分光光度计。,光谱分析（Spectral Analysis）：指所有对物质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。光谱分析法：基于物质发射的电磁辐射及电磁辐射与物质的相互作用而建立起来的分析方法。,二、 实验原理,吸收光谱（absorption spectrum）即物质对不同波长光的吸收程度不同而产生的光谱。发射光谱是由物质分子或原子吸收了外来的能量后发生分子或原子间的能级跃迁而产生的光谱。,物质的吸收光谱:在连续光谱中某些波长的光被物
2、质吸收后产生的光谱被称作吸收光谱,包括分子吸收光谱和原子吸收光谱。吸收光谱取决于物质的结构。,朗伯-比尔定律： I0：入射光强度 C:溶液浓度 b:液层厚度 I:透射光强度 T:透光度 A:吸光度 k:吸光系数,I0,I,朗伯-比尔定律的适用条件： 1.入射光为单色光。波长范围越大，单色光纯度越低，偏离越大。 2.溶液中邻近分子的存在并不改变每一给定分子的特性，即分子间互不干扰。（稀溶液） 3.适用于分子吸收和原子吸收。,分光光度计:能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器。分析精密度高测量范围广分析速度快样品用量少,根据使用的波长范围不同分为紫外光区、可见光区、红外光
3、区以及万用（全波段）分光光度计等。,紫外-可见分光光度计：工作波段在200nm800nm的分光光度计。其中：200nm400nm为紫外光区。400nm800nm为可见光区。属于分子吸收光谱仪。,721 可见分光光度计,722系列 可见分光光度计,SP-756P紫外可见分光光度计,吉天的六通道和普析通用T6系列紫外/可见分光光度计,岛津UV2550紫外可见分光光度计,光源,单色器,吸收池,检测器,显示系统,紫外-可见分光光度计的基本结构示意图,光源（light source）：提供入射光的装置。 要求: 1.能在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱； 2.有足够的辐射强度并能长时间稳定。常用的光
4、源有热辐射灯（钨灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等。,几种常见光源比较,单色器（Monochromator）：是将来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的装置。入射狭缝：限制杂散光进入；色散元件：将复合光分解为 单色光，有棱镜和光栅两种；准直镜：将来自色散元件的 平行光束聚集在出射狭缝上；出射狭缝：将固定波长范围 的光射出单色器，可以限制 通带宽度。,吸收池（absorption cell）：是用来盛放被测溶液的器件。在可见光区常用无色光学玻璃或塑料制作；在紫外区需用能透紫外线的石英或熔凝石英制作。同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射应严
5、格保持一致。指纹、油污及池壁上的沉淀物都会影响吸收池的透光性能。,通过改进吸收池的几何形状，可提高“光程/体积比”，即尽可能延长单位体积的光程。常用的有： 微型吸收池（Microdrill absorption cell） ：“光程/体积比”提高了近10倍。 多光路吸收池（Multipie-path absorption cell）：在吸收池壁上装有反射镜，使光线在溶液中经多次反射后才离开吸收池，大大增加了有效光程，提高了测定的灵敏度。,检测器：把光信号转换为电信号的装置。对检测器的要求： 1、产生的电信号与照射到它上面的光强有恒定的函数关系； 2、波长响应范围大； 3、灵敏度高； 4、响应速
6、度快，一般要求小于10-8s； 5、产生的电信号易于检测、放大，噪声低。,检测器工作原理,光照射在某些金属表面，会有光电子从金属表面逸出，这种光电效应称为外光电效应。利用外光电效应可以制成光电管和光电倍增管。光深入到物体内部，将物体内部原子中的一部分束缚电子激发成自由电子，但这些电子并不逸出物体，而是留在物体内部从而使物体导电性增强，称为内光电效应。利用内光电效应可制成光敏电阻、光敏二极管以及光电池。,几种常用检测器比较,信号显示系统: 是把放大的信号以适当的方式显示或记录下来的装置。,影响分光光度法准确性的因素,单色性不纯的影响 杂散光的影响 吸收池的影响 电压、检测器负高压波动的影响 其它
7、因素的影响,光度线性范围指仪器光度测量系统对于照射到接收器上的辐射功率与系统的测定值之间符合线性关系的功率范围，即仪器的最佳工作范围。检测方法溶液稀释法：配制适当浓度的溶液，按照一定的倍数逐步稀释，分别测定其吸光度，根据测得的吸光度计算吸光系数，以吸光度为横坐标，相应的吸光系数为纵坐标，绘制吸光系数-吸光度曲线，曲线的平坦区域即为仪器的线性范围。,三、 实验仪器与试剂 仪器：紫外可见分光光度计，试管，试管架，容量瓶， 烧杯，吸管，玻璃棒 试剂：牛血清白蛋白溶液(1mg/mL),四、操作方法。,1含量为100500g/mL牛血清白蛋白的光吸收情况。（P177，表12-5）2.含量为0.10.5g/mL牛血清白蛋白的光吸收情况 。 （ P177，表12-6）,五、注意事项1溶解牛血清白蛋白时不可剧烈搅拌，避免产生泡沫。2分光光度计用氘灯，比色时用石英杯。,
