1、Talos电镜 低温样品检查 基本操作流程 （ SerialEM版） 一、 预检 1.开启 Col. Valves 上样完成后， 待电镜 Column值低于 20 Log后 打开低温样品杆 shutter， 待 Column值低于 10 Log后开启Col. Valves。 开启后： 2.低倍 检查样品 放下荧光屏， 把放大倍数调至 100 X左右， 低 倍下检查载 网 支持膜的 完整度、冰层厚度、是否有严重污染等情况， 将合适的网孔移动到荧光屏上小圈位置 ，并 在 Stages界面 选择并记录 下 适宜进行数据收集的网孔 位置 。 3.自动 聚焦与成像 使用 FEI Low dose 或者
2、Serial EM Low dose mode （注：两者只能选其一，不可同时开启） 进行聚焦与高倍成像 ，具体步骤如下（此处主要介绍 Serial EM Low dose mode）： 选择目标网孔，并将 Stage移动到该位置，开启 Serial EM（确认 TIA已经 处于开启状态） ， 勾选 Low dose mode（ 1） 。 放下电镜荧光屏，依次选择图中 Area to show when screen down（ 2） 中的 Vie.， Foc.， Tri.， Rec.，查看放大倍数， dose rate是否符合 实际 要求。其中， Low Dose Mode下的文本显示当前成
3、像模式下的实际状态参数 （ 3） 。 View模式为低倍（ 2000-4000倍即可），低剂量（ 0.1e/2/sec），用于搜索拍照位点。 Record模式是真正的数据收集模式，按照所需的 pixel size选取适当的放大倍数（确定数据收集放大倍数后，按下控制面板中 Eucentric Focus使 Obj lens值到 85.6750%（ Talos）或者 79.6164%（ Titan），然后再根据具体的剂量要求通过电镜面板上的 intensity 旋钮，调整到合适的 dose rate（ 如剂量调整范围不能满足要求，可以结合调整 Spot size 实现 ） 。 focus模式是 S
4、erialEM的聚焦模式，通常设置和 Record模式倍数相同 （ 4） ，光斑大小可以在充分覆盖相机 的前提下适当缩小。 Trial模式是光斑自动居中模式，设置与 focus模式一致即可。也可通过勾选 Keep Focus and Trial identical选项 （ 5） 自动将 Trial模式和 focus模式设置成一致。 当修改了放大倍数或者 intensity时，需要勾选 continuous updata mag & beam（ 6） ，来更新状态，然后再取消勾选 continuous updata mag & beam来保护当前状态不被修改。 以上设置完成后， 在 Serial
5、 EM中 Camera & Macro Controls面板中点击 View，获得一张 View模式下的图片。 （ 1） （ 2） （ 3） （ 4） （ 5） （ 6） 获得低倍图片 右键拖拽该图片， 使目标区域位于红十字叉中心，即可 定位到该区域（ 为了便于聚焦，该步骤 最好定位在碳膜上） 。 定位完成后，点击 View刷新当前界面，确认目标区域定位正确（位于红十字叉中心 ），然后点击 Z_focus运行自动聚焦 Macro，完成后，样品 成像区域 将位于 正焦点 ， 之后可通过调整 Z轴高度 使 之 达到目标欠焦值（最好不要使用“ defocus”钮，这可能会造成后期数据收集不在 Euc
6、entric Focus上进行） 。 欠焦值设定 完成后，点击 view回到低倍模式，右键拖拽到成像区域，点击 Camera & Macro Controls面板中 Record成像即可。 4.自动 数据收集 如要进行 自动 数据收集， 详情参见 利用 SerialEM进行单颗粒数据收集的流程 二 、 合轴 （本步骤不建议普通用户自行操作，如需请联系电镜管理员） （进行此步骤操作前 ， 请确保已经点击 控制面板中 Eucentric Focus 使 Obj lens值到 85.6750%（ Talos），并使用 SerialEM的 Z_focus自动聚焦至正焦 ） 选择 Area to sho
7、w when screen down中的 Rec.（数据收集模式），放下荧光屏 （照明区域最好为碳膜上），调出 Apertures取消物镜光阑 （ Objective： none） ， 退出 Serial EM中的 Low dose mode： 调出 Direct Alignments，开始电镜合轴相关操作 ： 1. Gun Shift： 39合轴 点中 Direct Alignments下 Gun Shift， 将 spot size选定在 3， 缩小光斑到最小， 使用控制面板上多功能按钮 X Y将光斑居中（如下图所示）： 将 spot size选定在 9，使用控制面板上样品台滚轮将光斑居中
8、（如下图所示）： 如此反复调整，直至 Spot size在 3、 9之间转换时，光斑始终在屏幕最中央 即可 。 调整完成后，点击Done，完成 Gun Shift操作 。 点击 Done： 2. Beam tilt pp X & Beam tilt pp Y 点击 Beam tilt pp X（ Y） ， 将光斑缩小到合适大小 ， MF X 将变为 Piv pt bm tilt X（ Y） ： 查看 Beam tilt过程中 光斑是否存在偏移量，若有（如 下 左图），则通过调整 MF X 和 MF Y消除该偏移量 （如 下 右图所示） 。 调整完成后，点击 Direct Alignments下
9、方 Done。 3. Beam shift ( Tomo beam shift ) 点击 Beam shift（若进行 Tomo数据收集，则此处选择 Tomo beam shift） ，将光斑缩小至最小，观察光斑是否居中，若否（如下图左），则通过调整 MF X和 MF Y将光斑居中 。调整完成后，点击 Direct Alignments下方 Done。 4. Rotation center ( Tomo Rotation center ) 点击 Rotation center（若进行 Tomo数据收集，则此处选择 Tomo Rotation center） ， 将光斑调整到合适大小， 移动 S
10、tage， 使得视野正中央有明显目标物，观察 光斑转动过程中，目标物图像是否只存在大小缩放，没有位置平移 ，若否，则通过调整 MF X进行调节，直至目标物图像只在原位大小缩放为止。 调整完成后，点击 Direct Alignments下方 Done。 5. Coma-free Pivot Point X（ Y） 点击 Coma-free Pivot Point X（ Y） ： 缩小光斑到合适大小，观察光斑是否存在偏移量，若有（如下左图），则通过调整 MF X和 MF Y消除该偏移量（如下右图所示）。调整完成后，点击 Direct Alignments下方 Done。 6. Coma-free
11、Alignment X ( Y ) 将光斑扩大到覆盖整个相机成像区域， 抬起荧光屏， 调出 CCD/TV Camera 面板， 设定 Integration time到 0.25s， Sampling： 2， 点击 Preview以及 Live FFT， 调出 TIA界面： 点击 Coma-free Alignment X（ Y）： 观察 两个 交替变化的 成像状态下椭球形 傅里叶环 的长轴是否有变化，若有（如下图组所示）： （状态一） （状态二） 则需通过调节 MF X使得两个交替变化的成像状态下椭球形傅里叶环的长轴 基本相同 。 调整完成后，点击 Direct Alignments下方 D
12、one。 三、 消 象散 放下荧光屏， 将光斑扩大到覆盖整个荧光屏， 调出 Apertures， 根据实际需要插入物镜光阑： 点击控制面板上 Diffraction进入衍射模式，如下图所示： 观察光阑与光斑是否同心，若否（见上图），点击物镜光阑右侧 Adjust，通过 MF X和 MF Y将光阑与光斑调整到同心 （见下图） 。 调整完成后， 再次点击 Adjust结束 本次 调整 。 以上步骤调整完成后，再次点击控制面板上 Diffraction退出衍射模式 ， 将光斑扩大到覆盖整个相机成像区域，抬起荧光屏，调出 CCD/TV Camera 面板，设定 Integration time到 2s， Sampling： 1，点击 Preview以及 Live FFT，调出 TIA界面，观察 FFT环是否 有 为正圆形 ： 若否， 调出 Stigmator， 点击 Condenser（或者 Objective） ，使用 MF X 和 MF Y调整到 FFT环呈现正圆形 （如上图所示） 。 调整完成后点击 None，结束本次调整。
