1、金葡菌在实际检测中 常见问题的讲解,微球菌科 （Micrococcaceae） 葡萄球菌属 微球菌属 口腔球菌属 游动球菌属,病原性球菌,又称为化脓性球菌 根据革兰染色性的不同可分成 革兰阳性：葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌等 革兰阴性：脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。,葡萄球菌属 （Staphylococcus）,伯杰鉴定细菌学手册第9版（1994），葡萄球属目前分为32个种及亚种。 葡萄球菌最先由Koch1878）在脓汁中发现。,概述,分布广泛葡萄球菌广泛分布于自然界，如空气、土壤及各类物品上。人类和动物是葡萄球菌寄居的场所，主要存在于人的鼻腔和皮肤，在皮肤的毛囊、汗腺及皮脂腺内可存活很久。在家
2、畜的皮肤及乳腺等处也常分离到。葡萄球菌可通过这些部位播散到空气、尘埃及各类物品上。 所致疾病（常见、特殊）金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至账血症、脓毒症等全身感染。近年来，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒越来越多，在美国，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。,葡萄球菌与食物的关系：,对于食物的污染主要来自人的鼻腔及患有疖肿的人用手去触摸食品所致。调查结果表明，金葡菌对乳制品、肉类、家禽、蔬菜等各类食品，均可造成不同程度的污染。这些污染除来自人体外，也可来自动物体。但动物源性的葡萄球菌一般不造成人类的感染。如
3、生肉上分离的菌株多来源于动物体，加工后产品所带菌株多来源于人体。,葡萄球菌与食物的关系：,近年，按照生态学及致病性特征将葡萄球菌分为三大类：寄生于人体（腐生葡萄球菌、头葡萄球菌、人型葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌）、寄生于动物体（家畜葡萄球菌、中间型葡萄球菌）、寄生于人及动物（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌等）,葡萄球菌与食物的关系：,葡萄球菌对干燥有一定的耐受性，在干燥的衣物上可存活36个月。对热比较敏感，巴氏消毒可杀死牛奶中金葡菌。然而，葡萄球菌肠毒素却十分耐热。 葡萄球菌的最适培养温度为37，低于1012则细菌不繁殖。 葡萄球菌为耐盐菌，在10 15%盐浓度下仍可繁殖。因此，在一些腌
4、制的肉和海产品中，此菌仍有繁殖的可能性。,一、生物学性状 形态与染色,葡萄球菌 球形或椭圆形，典型排列呈葡萄串状 无鞭毛，无芽胞，体外培养时一般不形成荚膜 易被常用的碱性染料着色，革兰染色为阳性 链球菌 球形或椭圆形，呈链状排列 无芽胞。无鞭毛。培养早期（24h）形成透明质酸的荚膜，有菌毛，含型特异的M蛋白 易被普通的碱性染料着色，革兰染色阳性,培养特性,营养要求不高，最适生长温度为37。最适pH为7.4 在普通琼脂平板上孵育2448h后，形成菌落。菌落因种不同而出现金黄色、白色或柠檬色等色素 血琼脂平板上，有的菌株菌落周围形成明显的全透明溶血环（溶血）,金黄色葡萄球菌普平板,金黄色葡萄球菌血
5、平板,溶血性链球菌,抗原构造,葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A, SPA） 荚膜 多糖抗原,二、致病性,金葡感染,致病物质,酶 凝固酶、纤维蛋白溶酶、耐热核酸酶、透明质酸酶、脂酶等 毒素： 细胞毒素（、杀白细胞素）、表皮剥脱毒素、毒性休克综合征毒素-1、肠毒素等 其他： 粘附素、荚膜、胞壁肽聚糖等,凝固酶（coagulase）,概念 使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质 意义：鉴别有无致病性的重要指标 致病机理： 抵抗吞噬细胞的吞噬 保护病菌不受血清中杀菌物质的破坏 使感染局限化和形成血栓,肠毒素（enterotoxin） 约1/3临床分离的
6、金黄色葡萄球菌可产生肠毒素 引起急性胃肠炎即食物中毒 作用机制：到达中枢神经系统后刺激呕吐中枢而导致以呕吐为主要症状的食物中毒 表皮剥脱毒素（exfoliative toxin） 表皮剥脱毒素引起的烫伤样皮肤综合征（staphylococcal scalded skin syndrome, SSSS），又称剥脱性皮炎，多见于新生儿、幼儿和免疫功能低下的成人 具有抗原性，可被甲醛液脱毒成类毒素 毒性休克综合征毒素-1 （ TSST-1） TSST-1可引起机体发热，增加对内毒素的敏感性 感染产毒菌株后可引起机体多个器官系统的功能紊乱或毒性休克综合征（TSS） TSST-1可能不是引起TSS的唯一
7、病因，革兰阴性杆菌内毒素、葡萄球菌肠毒素和溶血素等与TSS的发病也有密切关系,杀白细胞素（leukocidin） 只攻击中性粒细胞和巨噬细胞，在抵抗宿主吞噬细胞，增强病菌侵袭力方面有意义 葡萄球菌溶素（staphylolysin） 损伤细胞膜的毒素，主要是溶素 溶素，对多种哺乳动物RBC有溶血作用。对白细胞、血小板、肝细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞等均有损伤作用 溶素是一种外毒素，具有良好的抗原性；经甲醛液脱毒后可制成类毒素 耐热核酸酶（heat-stable nuclease） 致病性葡萄球菌能产生该酶。耐热，经100 15min或60 2h不被破坏；能较强的降解DNA和RNA。 耐热核酸
8、酶可作为测定葡萄球菌有无致病性的重要指标之一,葡萄球菌对人体的致病作用：,葡萄球菌的主要致病物质是葡萄球菌肠毒素，它是葡萄球菌的某些菌株在适宜的条件下产生的一种碱性蛋白质。到目前为止，已确定有5个血清学构造完全不同的肠毒素：A、B、C、D、E。 金葡菌中约有1/31/2的菌株具有产生一种或多种型别肠毒素的特性。 产毒株在含碳水化合物及蛋白质的食品中易产生肠毒素，一般认为在37 40，pH 6.0 8.0等条件下有助于肠毒素产生，如果温度低于15，则不能形成肠毒素。,葡萄球菌对人体的致病作用：,葡萄球菌肠毒素几乎是细菌蛋白质类毒素中唯一耐热者。有实验证明，金葡菌肠毒素经煮沸3040分钟后，并未完
9、全破坏，仍能引发呕吐。由于该菌的耐热性，如果食品中原已有大量金葡菌繁殖，并产生了足量的毒素，在加热处理后，金葡菌已被杀灭，而耐热肠毒素仍能保持其生物活性。,葡萄球菌对人体的致病作用：,葡萄球菌肠毒素与葡萄球菌其它酶类之间除了凝固酶及耐热核酸酶外，目前尚未找到其它相关性。产肠毒素菌株绝大多数为凝固酶阳性菌株，但也有少数报道为凝固酶阴性的菌株产生肠毒素。 近代发现，耐热脱氧核糖核酸酶（DNase)与肠毒素产生的关系甚为平行。有学者认为，两者符合率在98%以上。DNase最适pH为9.0，10030分钟不被破坏。,葡萄球菌对人体的致病作用：,实验证实产生高度核糖核酸酶（RDase)的葡萄球菌80%的
10、菌株产生A型和B型肠毒素。 由于核酸酶的检测方法简单、快速，具有一定的特异性，故可做为产葡萄球菌肠毒素的间接指标。,葡萄球菌对人体的致病作用：,在食品中如果有大量产生肠毒素的葡萄球菌生长，就会生成足够量的肠毒素。当人们食入这种食品，就会造成食物中毒。引起食物中毒的多为奶制品、熟肉类以及含淀粉较高的米饭、糕点等。,葡萄球菌对人体的致病作用：,葡萄球菌引起的食物中毒潜伏期短，一般在食后26小时内发生比较剧烈的呕吐，也可伴有腹痛及腹泻，体温不升高。有的表现为流口水、恶心、干呕及腹部痉挛。经12天后，多可自愈。很少引起死亡。有人通过对引起食物中毒的食品进行定量测定，认为引起人中毒的最小剂量是1.0 7
11、.2gkg-1。,葡萄球菌对人体的致病作用：,关于呕吐产生的机制，曾有学者用猴子进行过研究。结果表明，对猴子催吐作用的部位是在腹部内脏感受器，然后将刺激经迷走神经及交感神经传到呕吐中枢引起呕吐。,葡萄球菌对人体的致病作用：,B型肠毒素除可引起食物中毒外，已是标准化的失能性生物战剂。美国学者曾用B型肠毒素给猴子静脉注射，动物在5分钟内，心电图呈现早搏或心律不齐，甚至造成死亡。,四、微生物学检查法,标本 直接涂片镜检 分离培养和鉴定 葡萄球菌肠毒素检查,小猫试验,微生物检查法,分离培养,血浆凝固酶 发酵甘露醇 耐热核酸酶,直接涂片镜检,革兰阳性葡萄球菌,生长现象,色素，溶血，,生化反应,毒素检查,
12、1常规分离鉴定技术 检样处理、增菌及分离培养鉴定：可按GB/4789.10-2003和SN 017292 出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法进行。,1、BP培养基胰蛋白胨 10.0g 氮源和氨基酸 牛肉粉 5.0g 氮源和氨基酸 酵母粉 1.0g B族维生素 丙酮酸钠 10.0g 生长促进剂 甘氨酸 12.0g 生长促进剂 氯化锂 5.0g 抑制革兰氏阴性菌生长 琼脂 15.0g 凝固剂 蒸馏水 950.0mL亚碲酸钾卵黄增菌液50ml 最终pH7.00.2 将各成分加于蒸馏水中,加热煮沸使完全溶解,冷至25,调至pH7.00.2, 分装每瓶95 mL,121高压灭菌15 min,临用时加热溶化
13、琼脂,冷至50左右,于每95mL 加入预热至50的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL,摇匀后倾注平皿培养基,应是致密不透明的, 使用前在冰箱贮存不得超过48 h。 亚碲酸钾抑制除金黄色葡萄球外的革兰氏阳性菌生长。卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环。卵磷脂酶阳性的金黄色葡萄球菌分解亚碲酸钾形成黒色菌落，并分解卵磷脂形成一个透明环。,金黄色葡萄球菌的典型特征：在B-P平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润,直径23mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带(卵磷脂环)。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,
14、其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。,在BP平板上的典型菌落,致病性葡萄球菌的鉴定,凝固酶（+）：取培养后肉浸液肉汤培养基及空白肉浸液肉汤培养基各0.5ml加入溶解后冻干兔血浆0.5ml的小试管中，振荡摇匀，置37温箱内，每半小时观察一次，观察6小时，如出现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。阳性、阴性对照。 触酶试验（+）：取营养琼脂平板上单个菌落于干净的玻片上，滴加8%H2O2溶液1滴，有气泡出现。,致病性葡萄球菌的鉴定,耐热核酸酶（+）：将检测菌的过夜培养肉汤沸水浴15分钟后，加进甲苯胺蓝核酸
15、琼脂上已打好的直径为2-5mm的孔内，置35 孵育，每一小时观察结果。环绕孔周的兰色琼脂转变为粉红色为阳性。 金黄色色素（+） 溶血性（+）：金黄色或白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。 发酵甘露醇（+）：,凝固酶阳性葡萄球菌的鉴别,金黄色 中间型 希氏 葡萄球菌 葡萄球菌 葡萄球菌 结合型血浆凝固酶 + - + 游离型血浆凝固酶 + + - PYR试验* - + + 耐热核酸酶 + + + V-P试验 + - + 鸟氨酸脱羧酶试验 - - - PYR试验：鉴定产生吡咯烷酮芳基酰胺酶的细菌,三种葡萄球菌的主要生物学性状,葡萄球菌的鉴定,半自动细菌鉴定系统，是由微量生化检测系统
16、发展而来。其原理也是将各种不同的生化反应组成专一鉴定试剂条(或板)。经培养后用光电读数器自动读数，将数据自动传送到计算机，由计算机分析处理，并打印结果分析报告。这一类的鉴定系统主要有：ATB(法国梅里埃公司)、BIOLOG(美国BIOLOG)等，半自动微生物鉴定系统除了鉴定微生物外，也可进行药敏试验。每一系统都有其分析特点，用户可根据需要选用。,金黄色葡萄球菌,2流行病学分型技术 血清学分型：绝大多数金黄色葡萄球菌含A型多糖抗原，浆凝固酶阴性的菌株含B型多糖抗原，而致病与非致病的菌株均含有C型多糖抗原。 噬菌体分型：根据国际小组第6次会议通过的金黄色葡萄球菌噬菌体分为4个群23个型，生产肠毒素
17、引起食源性疾病的菌株主要是群与群。 肠毒素分型：将分离获得的菌株使用产毒培养基，采用透析膜培养方法进行产毒培养，并将获得的培养液进行浓缩提纯后可按食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB/T4789.10-2003方法进行肠毒素的测定。 脉冲场电泳（PFGE）分子分型：Hennekinne等（2003年）对73株不同来源的金黄色葡萄球菌（属于八个生物型），进行Smal-PFGE分型，结果有61个PFGE分型模式。PFGE对辨别金黄色葡萄球菌是有效的，并且比生化分型法有更强的辨别力。,1 在一些检测试验中，会有溶血试验， -溶血环的现象是什么？,甲型溶血性链球菌：称甲型溶血或溶血，溶血环中的红
18、细胞并未完全溶解。多为条件致病菌。（肺炎链球菌） 乙型溶血性链球菌：称乙型溶血或溶血，溶血环中的红细胞完全溶解，致病力强。 丙型链球菌：无溶血环，一般不致病。 链球菌按多糖抗原，可分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群，近年又增加U、V群，共20群。对人致病的链球菌菌株，90%左右属A群。 链球菌的群别与溶血性间无平行关系，但对人类致病的A群链球菌多数呈现乙型溶血,2 对于副溶血型弧菌的检测，如果只要求检测是否存在，而不要求得出MPN值的话，可否象沙门氏菌的检测一样，直接进行前增菌和选择性增菌？如果可以，是否有规可依？可有参考步骤？,食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验 GB/T4789.07-2003.,1. 无菌称取25g（ml）样品加225ml3.5%灭菌盐水，磨碎或均质，接种TCBS平板1个，同时取10ml，加入100ml氯化钠结晶紫增菌液中，放37 18-24h培养后，涂TCBS平板进行分离，放37 18-24h培养后取出观察。 2. 挑取上述可疑菌落，转种3.5%氯化钠三糖铁斜面，放3724 h观察结果。 3. 凡是三糖铁培养基反应为底层变黄葡萄糖产酸不产气，斜面不变乳糖蔗糖不分解，有动力，不产硫化氢，革兰氏染色镜检为G-弧菌者，进行生化仪器和（或）血清学等鉴定。,谢谢！,
