1、CHIP 步骤实验前准备：处理细胞，将细胞保持在装有 20ml 培养基的 150mm 培养皿中。冰预冷 PBS（第 3 步）、培养皿（第六步）。每个 150mm 培养皿准备 42ml1*PBS(10*PBS 4.2ml+水 37.8ml),冰上预冷。预热 SDS 到室温，确保在细胞裂解之前彻底溶解。将 protease inhibitor cocktail II 放置室温待用。A 体内交联和溶解1、加 550 l 37%的甲醛（或 1.15ml 新鲜的 18.5%甲醛）到 20 ml细胞培养基中进行交联反应，轻轻地晃动混匀。甲醛的终浓度为 1%。尽量使用新鲜的甲醛（配置方法见附录 B）。2、室
2、温下孵育 10 min。不要振荡细胞。3、取 2 ml 冰冷的 1*PBS 于分离管中至于冰上（每个培养皿对应一个），每 1ml PBS 中加 5 ul Protease Inhibitor Cocktail II。4、加 2 ml 10Glycine 到培养皿中将未反应的甲醛消除。5、晃动混匀并在室温下孵育 5 min。6、将培养皿放在冰上。7、吸出培养基，尽可能的将培养基去除干净，小心不要扰乱细胞。8、加 20 ml 冰冷的 1*PBS 来洗涤细胞。9、除去 PBS，再用 PBS 洗涤一次。10、加 2 ml 含 1Protease Inhibitor Cocktail II 的冷 PBS
3、 到培养皿中(从第 3 步得) 。11、将细胞从培养皿刮下来放到离心管中。12、4，700 g（9001000 rpm）离心 25 min 沉淀细胞。13、准备好 1 ml(1*107 个细胞推荐 1ml) SDS Lysis Buffer（含 5ul Protease Inhibitor Cocktail II）。14、除去上清液（此步中的细胞沉淀可以放在-80中保存）。15、用准备好的 1 ml SDS Lysis Buffer(含 1* Protease Inhibitor Cocktail II）重悬细胞。16.能整除 300400ul 的微型管。（溶解产物可放在-80 储存）17 如
4、果超声条件理想直接进行 B 部分，否则查看附录 A。B 超声断裂 DNA实验前准备：选择最佳的超声条件来打断交联的 DNA，使其长度为 2001000 bp（查看附录A）。1、需要的话，从步骤 A-16 中取 5 l 细胞裂解液进行电泳检测未打断的 DNA。2、在冰上超声处理细胞裂解液。（条件摸索）3、4 1000015000 g（12000 rpm）离心 10 min 除去不溶解的沉淀。4、有需要的话，可以取出 5ul 打断的 DNA 电泳检测超声效果。5、将上清液吸到一个新的离心管中，100ul 一份。 每 100l 包含 106 个细胞的裂解产物，可以用来做一次免疫沉淀反应。 打断的交联
5、染色质可以在-80中保存 2 个月。C、Immunoprecipitation (IP) of Crosslinked Protein/DNA实验前准备：取出 Protease Inhibitor Cocktail II 在室温融化（步骤 3 用）。1、准备足够的 Dilution Buffer（含 protease inhibitors），放在冰上。 每个 IP 实验需要 900ul Dilution Buffer 和 405 ul Protease Inhibitor Cocktail II。 测试样品包括：阳性对照 Anti-RNA Polymerase II，阴性对照 Normal M
6、ouse IgG，和自己实验用的抗体。建议增加一个与自己所用抗体同源的阴性对照IgG。 2、准备一个微型离心管包含 100ul 打断的交联好的染色质(B-5) 放在冰上。 若用同一样品进行多个免疫沉淀反应，可将 1.1 ml 样品放在一管中进行实验。 每 100ul 包含 1*106 细胞来做免疫沉淀。3、加 900ulDilution Buffer（含 Protease Inhibitor Cocktail II）到100ul 染色质样品中。4、每一个 IP 加 60ul Protiein G Agarose。 Protiein G Agarose 是一个 50%混悬液，吸取前轻轻的颠倒混匀
7、。5、4旋转孵育 1 h。6、瞬离颗粒琼脂糖 30005000g 1min。 不要高速离心7、取出 10ul（1%）上清液作为“Input”并放在 4直到步骤 D-1。8、收集剩余的上清液，分装到 1ml 的微型管中，倒掉颗粒。9、加入免疫沉淀抗体 阳性对照 anti-RNA Polymerase，加 1.0 g 抗体每管。 阴性对照 Normal mouse IgG，1.0 g 抗体每管。 用户使用的抗体和对照，每管加 110 g 抗体每管（根据抗体效价进行调整）。 10、4旋转孵育过夜。11、每个 IP 加 60ul protein G Agarose4 度颠转一小时。12、将 Prote
8、in A magnetic beads 瞬离（30005000g,1min）沉淀下来并除去上清。13、用 1 ml 下列冷的缓冲液洗脱 Protein A bead-antibody/chromatin complex，每次在旋转台上孵育 35 min，瞬离（ 30005000g,1min）并小心的除去上清。a、Low Salt Immune Complex Wash Buffer (Cat.# 20-154), one wash b、High Salt Immune Complex Wash Buffer (Cat.# 20-155), one washc、LiCl Immune Compl
9、ex Wash Buffer (Cat.# 20-156), one washd、TE Buffer (Cat.# 20-157), two washD、洗脱 Protein/DNA 复合物实验前准备：1M NaHCO3 放至室温，打开水浴锅温度调至 65。（E 部分用）1、为所有的 IP 管和 Input 管准备最终的的洗脱液。 每管用的洗脱液 200ul(10ul 20% SDS,20 ul 1M NaHCO3, 170ul 无菌水，蒸馏水）。2、准备一个大的收集管，比如，是个收集管混合一起是 105ul 20%SDS,210ul 1MNaHCO3,1.785ml 无菌水，蒸馏水。3、In
10、put 收集管（C-7）中加入 200ul elution buffer 放至室温直到 E部分。4、往所有的收集管中加入 100ul lution buffer，包括 antibody/agarose 复合物。轻轻混匀。5、室温孵育 15min.6、瞬离（30005000g,1 min）收集琼脂糖,将上清液吸至一个新的收集管中。7、重复 4-6 步，将洗脱液收集起（总共约 200ul）。E、反交联 Protein/DNA 复合物为单独的 DNA。1、所有收集管包活 IP 和 input 加入 8ul 5M NaCl,65 度孵育 45 小时或过夜。解交联 DNA 与蛋白复合物，这一步的样品可放
11、于负 20 度第二天再用。2、所有的收集管加入 1ul RNase 37 度孵育 30min.3、每个收集管中加入 4ul 0.5M EDTA,8ul 1M Tris-Hcl, 1ul Protocol K，42 度孵育 1-2 小时。F、 DNA Purification Using Spin Columns1、取出 Spin Filter 到 Collection Tube 中。从 E 一个样本对应一个分离管。2、加 1 ml Bind Reagent “A”到每个 200 l 的 DNA 样品管中（包括 ip 和 input）并混匀。 5 倍体积的 Bind Reagent “A”用于
12、1 倍体积的样品，可能有沉淀，但不影响。3、将 600 ul sample/Bind Reagent “A”混合液转移到 Spin Filter 收集管中。4、1000015000 g（12000 rpm）离心 30 s。5、从离心管中移除 Spin Filter 保留将 Collection Tube，并将离心液除去。 如果第 2 部形成的沉淀物能够在底部看到，但不影响实验。6、将 Spin Filter 放回 Collection Tube。7、将剩余的 600 ul sample/Bind Reagent “A”(从第二步来) 吸到Spin Filter 中并重复 4-6。8、加 500
13、 ul Wash Reagent “B”,到收集管的 Spin Filter。9、1000015000 g（12000 rpm）离心 30 s。10、从离心管中移除 Spin Filter 保留将 Collection Tube，并将离心液除去。11、把空的 Spin Filter 放回 same Collection Tube 中。12、1000015000 g（12000 rpm）离心 30 s。13、除去 Collection Tube 中的液体。14、将 Spin Filter 放到一个干净 clean 的 Collection Tube 中。15、将 50 ul Elution Buffer “C”加到 Spin Filte 的膜中心上。16、1000015000 g（12000 rpm）离心 30 s。17、除去 Spin Filte，洗脱液就是纯化的 DNA，可以用于检测或存于-20 。
