1、2013-11-26,实时荧光定量PCR技术 的原理及应用 （Real Time Quantitative PCR）,Contents,实时荧光定量PCR目录,实时荧光定量PCR的定义,普通,PCR,在PCR结束后对 进行定量分析,终点产物,PCR技术和荧光检测技术的结合通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好2、EB有毒，荧光太贵等缺点,实时荧光定量PCR的定义,PCR技术和荧光检测技术的结合通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR
2、产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。,实时荧光定量PCR的定义,？,为什么选择对初始模板定量 而不是终产物定量,RT-PCR技术的原理及试验流程,RT-PCR技术的原理及试验流程,荧光染料 SYBR Green I,荧光标记的探针TaqMan探针法,RT-PCR技术的原理及试验流程,Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）,变性,退火,延伸,RT-PCR技术的原理及试验流程,SYBR Green法优缺点,RT-PCR技术的原理及试验流程,RT-PCR
3、技术的原理及试验流程,Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）,RT-PCR技术的原理及试验流程,TaqMan法,TaqMan探针法优缺点,RT-PCR技术的原理及试验流程,绝对定量(Absolute Quantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究 相对定量(Relative Quantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究,RT-PCR技术的数据分析,相对定量通过内标定量,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,RT-PCR技术的数据分析,内标（Endogenous Control） 通常是1
4、8S、28S、-actin、GAPDH基因等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小,PCR分四个阶段,RT-PCR技术的数据分析,如何定量？,RT-PCR技术的数据分析,-Ct,PCR扩增循环数,扣除背景荧光后的相对荧光量,1. 荧光域值（threshold）的设定在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。,如何定量？,RT-PCR技术的数据分析,-Ct,PCR扩增循环数,扣除背景荧光后的相对荧光量,2. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代表thres
5、hold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图所示）。,如何定量？,RT-PCR技术的数据分析,-Ct,3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,PCR扩增循环数,扣除背景荧光后的相对荧光量,RT-PCR技术的数据分析,3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起
6、始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,RT-PCR技术的数据分析,相对定量分析方法 -Ct,前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏差在 5以内1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：CT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) CT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control) 2、用试验样本的CT值减校准样本的CT值：CT= CT
7、（test/control) - CT（calibrator)3、计算表达水平比率：相对表达量RQ= 2 CT,RT-PCR技术的数据分析,SYBR Green 熔解曲线分析,RT-PCR技术的数据分析,临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。 动物疾病检测：禽流感、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。 食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。 科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。 应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。,RT-PCR技术的应用,
