1、二、土壤微生物量碳、氮的测定方法熏蒸提取法 1 主题内容与适用范围本方法采用氯仿熏蒸提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。2 方法提要土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用 K2SO4 溶液浸提，提取液一部分用K2CrO7氧化法测定微生物量碳，另一部分用 浓 H2SO4 消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮。3提取液的制备3.1 仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量： 0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、 40C 的冰箱
2、 、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜3.2 试剂的制备：0.5 M K 2SO4 溶液（化学纯）、无醇氯仿（提纯方法：用 1N H2SO4 溶液与氯仿按体积比 2:1 于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做 3 次；再用水代替硫酸与氯仿 2:1 混匀，振荡分离，共 5 次，将提纯的氯仿放入到棕色 试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠，保存）3.3 分析步骤：3.3.1 称取 12.50g 鲜土(取土要准确、均匀，不要 夹入有机残体 )于大铝盒中。在抽气皿中放入盛有 25ml 无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾 5 分钟，关紧活塞，关闭抽气
3、机。包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸 24 小时。到时间后，取出小烧杯后反复抽真空 23 次（每次 5 分钟），排除氯仿。另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸 处理，同 样包上黑布，置于阴暗处 24 小时。3.3.2 将步骤(3.1.1) 中的两批土 样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。用注射器注入每瓶50ml 0.5M K2SO4 溶液，盖紧瓶塞，振 荡 30 分钟，离心 5 分 钟后取出，用 15ml 定量滤纸过滤到 150ml 大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保 鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在 40C 的冰箱中。4 生物量碳的测定K 2CrO7 氧化法4.1 仪
4、器、设备：DOC 测定仪( 冷凝装置 4 套、配套沸瓶装 16 个)、玻璃沸珠、 1500W 电炉两个、变压器两个、滴定管（25ml ）4.2 试剂的制备：蒸馏水、混合酸 (浓硫酸: 浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K2CrO7标准溶液邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N ）K2CrO7 溶液（19.6125g/L，分析纯）0.02M (NH4)2Fe(SO4)2 溶液：取 15.69g/L 溶于蒸馏水，用 20ml 浓硫酸（98%，分析纯）酸化，而后定容至 1L、4.3 分析步骤：4.3.1 吸取 2ml 0.4 N K2CrO7 溶液放入沸瓶，再吸 15ml 混酸放入沸瓶，
5、混合，加入等量的玻璃球（约一小药匙，10 个）。吸取步骤（3.2.2）中的过滤液 810ml（根据含碳量多少而定），放入到电炉上，安装好冷凝系统 ，调压至 130 伏开始加热。从玻璃球沸腾时开始记时，保持沸腾 30 分钟，其间应摇匀两次。在 30 分钟到前 2 分钟关上电 炉，利用余热保持沸腾至 30 分钟，随后从冷凝管上口加入 20ml 蒸馏水，清洗冷凝管壁，降低沸瓶温度。4.3.2 取下沸瓶，待冷却至室温，加入 23 滴指示剂，用准确标定过的(NH 4)2Fe(SO4)2 溶液滴定。颜色从黄色深绿色天 蓝色浅灰色（很短暂）红 棕色到终点。同 时用 0.5M K2SO4代替过滤液作空白，注意
6、两个 电炉间的差异。注：(NH 4)2Fe(SO4)2 溶液的标定：在三角瓶内放入 0.1000 N K2CrO7标准溶液 10ml，加入混合酸 15ml，摇匀冷却，用(NH 4)2Fe(SO4)2 溶液滴定，颜色反应同上。一般在测定开始和结束时各标定一次，取平均值，保留 4 位小数。4.4 分析结果的表述：计算公式：（1）C（ug/ml）=(V 空白 V 样品 )*N(NH4)2Fe(SO4)2*3*1000/吸取样品的体积数(ml)（2）C（ug/g）=C(ug/ml)*提取液的总体积数(ml)/W 干土 (g)（3）EC（ug/g）=C 熏蒸 （ug/g）C 未熏蒸 （ug/g）（4）微
7、生物量碳 BC（ug/g）=EC/0.38（ug/g）4.5 允许差4.5.1 取平行测定结果的算术平均值作为测定结果（一般做两次重复）。4.5.2 平行测定的绝对差值10ug/g。 （要求样品滴定时的绝对差值0.1ml）5 微生物量氮的测定消煮、碱化蒸 馏法5.1 仪器、设备：定氮仪、烘箱、开氏瓶（50ml）、移液管（50ml 、2ml、5ml）、小漏斗、小三角瓶（150ml）5.2 试剂的制备：去离子水、浓 硫酸（化学纯）、硼酸指示 剂、10M NaOH 溶液（化学纯）、CuSO4 溶液5.3 分析步骤：5.3.1 吸取步骤 3.2.2 中的过滤液 25-30ml 放入到开氏瓶（三角瓶）中
8、，加入 2ml 浓硫酸（固定滤液中的氨）。放入到烘箱中在 60700C 烘 23 天，直至瓶内还剩下 3ml 左右溶液，取出。加入 3ml 浓硫酸和 1ml0.19MCuSO4 溶液，放上小漏斗在 电炉上消煮。消至瓶内颜色呈天蓝色为止，取下冷却。同时用 0.5N K2SO4 溶液 50ml 代替滤液作空白。5.3.2 用去离子水洗清小漏斗内外壁，少量多次冲洗开氏瓶，将开氏瓶中的液体全部转移到定氮仪中，加入 20ml 10N NaOH 溶液进行碱化蒸馏，冷凝管下口放装有 5ml 硼酸指示剂的小三角瓶，接收蒸馏液，待蒸馏液达到 60ml 时停止蒸馏。蒸馏前应检查蒸馏装置是否漏气，并进行空蒸馏清洗管
9、道。5.3.3 用 0.02N 硫酸标准溶液滴定馏出液，加入指示剂，颜色由蓝色刚变成紫红色为终点，记录消耗硫酸标液的体积。5.4 分析结果的表述：计算公式：N （ug/g）=(VV0)*NH2SO4*14.0*稀释倍数*1000*2.22/W 烘干土微生物量氮 BN（ug/g）=N 熏蒸 N 未熏蒸其中： V ：滴定样品所消耗的硫酸数，ml；V0：滴定空白所消耗的硫酸数，ml；稀释倍数：总过滤液是所吸取的过滤液的倍数， ；2.22：无机氮转化为有机氮的转化系数。5.5 允许差5.5.1 取平行测定结果的算术平均值作为测定结果（一般做两次重复）。5.5.2 平行测定的绝对差值5ug/g。 （要求样品滴定时的绝对差值0.05ml ）
