1、PCR 各 步 骤 的 目 的（ 一 ） 预 变 性 ：破 坏 DNA 中 可 能 存 在 的 较 难 破 坏 的 二 级 结 构 。 使 DNA 充 分 变 性 ， 减 少 DNA 复 杂 结 构 对 扩增 的 影 响 ， 以 利 于 引 物 更 好 的 和 模 板 结 合 ， 特 别 是 对 于 基 因 组 来 源 的 DNA 模 板 ， 最 好 不 要 吝 啬 这 个步 骤 。 此 外 ， 在 一 些 使 用 热 启 动 Taq 酶 的 反 应 中 ， 还 可 激 活 Taq 酶 ， 从 而 使 PCR 反 应 得 以 顺 利 进行 。（ 二 ） 变 性 -退 火 -延 伸 循 环 ：
2、模 板 DNA 的 变 性 ： 模 板 DNA 经 加 热 至 93 左 右 一 定 时 间 后 ， 使 模 板 DNA 双 链 或 经 PCR扩 增 形 成 的 双 链 DNA 解 离 ， 使 之 成 为 单 链 ， 以 便 它 与 引 物 结 合 ， 为 下 轮 反 应 作 准 备 ； 模 板 DNA 与 引 物 的 退 火 (复 性 )： 模 板 DNA 经 加 热 变 性 成 单 链 后 ， 温 度 降 至 55 左 右 ， 引 物与 模 板 DNA 单 链 的 互 补 序 列 配 对 结 合 ； 引 物 的 延 伸 ： DNA 模 板 -引 物 结 合 物 在 TaqDNA 聚 合
3、酶 的 作 用 下 ， 以 dNTP 为 反 应 原 料 ， 靶序 列 为 模 板 ， 按 碱 基 配 对 与 半 保 留 复 制 原 理 ， 合 成 一 条 新 的 与 模 板 DNA 链 互 补 的 半 保 留 复 制 链 。（ 三 ） 用 PCR 仪 扩 增 时 ,(变 性 .退 火 ,延 伸 )循 环 完 成 后 ,继 续 72 度 延 伸 了 10 分 钟 的 原 因 ：1.延 伸 时 间 取 决 于 待 扩 增 DNA 片 段 的 长 度 。 （ 当 然 是 在 反 应 体 系 一 定 的 条 件 下 ） 例 如 ， 使 用 taqDNA 聚 合 酶 ， 72 度 时 的 碱 基
4、掺 入 率 为 35-100bp/s， 因 此 延 伸 速 率 为 1kb/min。2.根 据 延 伸 速 率 推 得 ， 扩 增 1kb 以 内 的 dna 片 段 1min 即 可 ， 而 3-4kb 则 需 要 3-4min， 依 次 照推 。 通 常 在 最 后 一 轮 要 适 当 的 将 延 伸 时 间 延 长 至 4-10min， 这 样 做 是 使 pcr 反 应 完 全 以 提 高 扩 增 产量 。3.继 续 72 度 延 伸 了 10 分 钟 除 了 可 以 使 pcr 反 应 完 全 以 提 高 扩 增 产 量 外 ， 还 有 一 个 作 用 是 ： 在 用普 通 taq 酶 进 行 PCR 扩 增 时 在 产 物 末 端 加 A 尾 的 作 用 ， 可 以 直 接 用 于 TA 克 隆 的 进 行 。
