1、一、工具酶,到 20 世纪 60 年代中期，人们已经认定限制和修饰是细菌遗传学领域中最重要和最有趣的现象（例子可见 Hayes，1968），但是谁会预见到限制酶将对生物学产生的巨大影响呢？ 那么，什么是限制酶？限制酶来自哪里呢？,寄主的限制与修饰有两方面的作用。一是保护自身的DNA不受限制，二是破坏外源 DNA, 使之迅速降解。根据限制-修饰现象发现的限制性核酸内切酶,现已成为重组DNA技术的重要工具。,限制和修饰现象,在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时
2、达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸
3、链，从而产生长度和序列一定的分离片段。,型限制内切酶的发现,突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind 。嗜血流感细菌还具有另一个型的限制酶 Hind ，而且含量很大。幸运的是，Hind 不切割T7 DNA，因此 Hind 制剂中可能混有的 Hind 将不产生任何问题（Old 等，1975）。在发现 Hind后不久，又分离
4、到其他几个型的限制性内切酶，并分析了它们的性质，EcoR是其中最重要的一个（Hedgepeth 等，1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。,限制和修饰（R -M ）的类型至少存在 4 种不同类型的 R -M 系统：类型、。它们之间的主要差异总结在表 3.1 中。按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等不同，传统上将限制性内切酶分为四大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则远远不止四类。,型限制性内切酶,是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。 以前认为型限制性内切酶很稀有，
5、但基因组测序分析发现这类酶其实很常见。尽管型酶在生化研究中很有意义，但其不 能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因而不具备实用性。,型限制性内切酶,能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。 型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称序列； 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，,最常见的 型限制性内切酶,在特异性识别序列内部切割 DNA，如 HhaI、HindIII 和 NotI，商业化酶多
6、属此类。它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称序列；但也有少量的酶与DNA 结合形成异二聚体，识别非对称序列（如BbvCI 识别 CCTCAGC）。一些酶识别连续性序列（如 EcoRI 识别 GAATTC，其中的两个半识别序列是相连的）；而另一些识别非连续性序列（如 BglI 识别CCNNNNNGGC，其中的两个半识别序列是不相连的）。,另一种比较常见的 型限制性内切酶,所谓的S 型酶，如 FokI 和 AlwI，它们在识别位点之外切开 DNA。这些酶大小居中，约 400-650 个氨基酸，由 DNA 结合域和切割 DNA 的功能域组成。它们识别连续的非对称序列。 一般认为这些
7、酶主要以单体的形式结合到 DNA 上，与邻近酶分子的切割功能域结合成二聚体，协同切开 DNA链。因此一些S 型酶在切割含有多个识别位点的 DNA 分子时活性更高。,FokI, 型限制性内切酶,也是一类较大的兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开 DNA 链，并且要求同一 DNA分子中存在两个反向的识别序列以完成切割。 这类酶很少能达到完全切割。,某些识别和切割独特的酶,BsmB, 型限制性内切酶,识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。,限制性内切酶切割后产生一个 3 -羟基和一个 5 -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们才有切割
8、活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小，亚基约 200-350 个氨基酸。,某些识别和切割独特的酶,限制性内切酶命名,由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系的一个简化版。其主要特征是：, 以限制性内切酶来源的微生物的学名来命名，多采用三个字母。微生物属名的首字母大写，种名的前两个字母小写。 若该微生物有不同的变种或品系，则再加上该变种或品系的第一个字母,但需大写；从同一种微生物中发现的多种限制性内切酶，依发现和分离的前后顺序用罗马数字区分。 限制性内切酶
9、名称的前三个字母用斜体表示，后面的字母、罗马数字等均为正体。同时，字母之间、罗马数字与前面的字母之间不应有空格(由于在现有的大多数软件排版时，当输入罗马数字时其会自动与前面的字母之间拉开半个汉字的空格，故在印刷体的书刊中就会看到罗马数字与前面的字母之间有空格)。,限制性内切酶命名,例如，从流感嗜血菌(Haemophilus influenzae) d 株分离的第三种限制性内切酶，表示为 Hind III； 从大肠杆菌(Escherichia coli)RT 株分离的第五种限制性内切酶，表示为EcoR V。,粘性末端的意义,限制性核酸内切酶通常可产生两种不同的粘性末端，一种是形成带有凸出的5磷酸
10、基团的粘性末端，如EcoR；另一种形成带有凸出的3羟基基团的粘性末端，如Pst。,同裂酶和新裂酶,偶尔人们会发现识别新的特异性 DNA 序列的酶，但已经证明大部分酶的特异性都与已知的酶相同。具有相同的序列特异性和切割位点的限制酶称为同裂酶。识别相同序列，但切割位点不同的酶，例如 Sma（CCC/GGG）和 Xma（C/CCGGG），有时称为新裂酶。,同尾酶,同尾酶是与同裂酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。 常用的限 制 酶 BamH、Bgl、Bcl、Sau3A、Xho就是一组同尾酶，它们切割 DNA之后都形成由GATC 4个核苷酸组成的粘性
11、末端。显而易见，由同尾酶产生的 DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的,因此在基因工程操作中很有用处。 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之“杂种位点”但这类杂种位点形成之后，一般不能再被原来的任何一种同尾酶所识别。,酶的星号活性,在极端的条件下（如高 pH 和低离子强度下），限制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列的序列，这种改变的特异性称为星号活性。 最常见的一类活性改变是允许碱基替代和识别序列中碱基的缺失。例如，EcoR （EcoR 星号活性）切割序列 N /AATTN，此处 N 为任意碱基，而EcoR 切割序列为 GAATTC。,酶的切
12、割温度和时间,DNA 消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。多数限制内切酶的最适反应温度是 37 ，少数限制性内切酶的最适反应温度却高于或低于 37 。 标准1小时, 对于许多酶，都可以用更少单位的酶消化 16小时。,缓冲体系,不同的限制性核酸内切酶对反应体系的离子强度和 pH 值有不同的要求。 限制性内切酶标准缓冲液的组分包括 MgCl2、NaCl 或 KCl、Tris-HCl、-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)、牛血清白蛋白(BSA)等。二价阳离子是酶活性正常发挥的必需条件，通常是 Mg2。不合适的 NaCl 或 Mg2浓度，不仅会降低限制性内切酶的活性，而且可能会导致识别序列
13、的特异性发生变化。 Tris-HCl 的作用是使反应混合物的 pH 值恒定在酶活性所要求的最佳参数的范围之内。对绝大多数限制性内切酶而言，pH7.4 是最佳的反应条件。巯基试剂的作用是保持某些核酸内切酶的稳定性，但它同样也可能有利于提高潜在污染杂质的稳定性。某些限制性内切酶的稳定性需要 BSA 来维持。,NEB公司的缓冲液成分（1X）,NEBuffer 1（黄色）： 10 mM Bis Tris 丙烷-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT（pH 7.0 25）。NEBuffer 2（蓝色）： 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1
14、mM DTT（pH 7.9 25）。NEBuffer 3（红色）： 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT（pH 7.9 25）。NEBuffer 4（绿色）： 20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg(Ac)2, 50 mM KAc, 1 mM DTT（pH 7.9 25）。,反应体积和甘油浓度,商品化的限制性内切酶大多使用 50的甘油缓冲液作为酶的储存液，以避免酶蛋白的反复冻融。 在酶切反应中，为了将甘油的浓度控制在 50以下，应该将酶的体积限制在总反应体积的 110 以内，否则酶活性会因为甘油浓度太大而受到抑制。,酶切反
15、应条件的优化,根据定义，在50 l体系中，1单位的限制性内切酶可以在60分钟内完全切割1 g的底物DNA。 当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如如何在正确的反应体系中，加入适量的 DNA、内切酶和缓冲液，就可以获得最佳酶切效果。 大多数科研人员会使用510倍的过量酶切割DNA，这样有利于克服由于 DNA来源不同、质量和纯度不同而造成的实验失败。,常用的酶切体系为20 l或50 l,不同厂家缓冲体系的等同性,双酶切体系的建立,选择最大程度上保证两种酶活性的缓冲液用于双酶切。为避免星号活性，建议选用 NEB 高保真内切酶。 只要其中一种酶需要添加 BSA，则应在双酶切反应体系中加
16、入BSA（BSA 不会影响任何内切酶活性）。 按推荐条件建立反应体系。反应体系中甘油的终浓度应 5 l。,按推荐温度温育。为避免星号活性不建议温育过夜做双酶切反应。如果需要两种不同温育温度，先选择理想的反应缓冲液，加入第一种酶在适合的温度下反应，热失活第一种酶后再加入第二种酶按推荐温度温育。在非优化反应缓冲液中反应时，根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。,不完全酶切,在质粒载体构建中，有时可以用到这一方法。,内切酶的保存和操作,大多数内切酶建议保存在 -20。只有少数内切酶若贮存时间超过 30 天建议保存在-70。详细的贮存信息请参阅内切酶使用说明书或目录。10X 反应
17、缓冲液和 BSA 贮存液也应保存在 -20。从冰箱取出后请一直置于冰上。 酶最后加入到反应体系中。 加入酶之前将反应混合物混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心，切忌振荡混匀。,酶切反应的终止,若消化后的 DNA 不需要进行后续的实验操作， 用终止液终止反应 50% 甘油、50 mM EDTA（pH 8.0）和 0.05% 溴酚蓝（NEB ）。按每 50 l反应体系中加入 10 l的比例进行。 有些厂家在内切酶包装中，会同时附上10loading buffer（1%SDS；50%甘油；0.05%溴酚蓝），使用添加反应液量的1/10，即可停止反应，进行电泳。 若消化后的 D
18、NA 需要进行后续的实验操作，用热失活法或酚/氯仿抽提去除内切酶。,目前国际主流的限制性内切酶厂家,New England Labs（美国） Takara（日本） Fermentas（立陶宛） Sibenzyme（俄罗斯） Promega（美国）,甲基化对酶切的影响,DNA 甲基转移酶（MTases）普遍存在于原核和真核生物中，能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者是胞嘧啶上。 当使用限制性内切酶消化 DNA 时，要考虑是否有甲基化的问题，这是因为如果识别序列中某个特定碱基被甲基化后，切割就会被完全或者不完全阻断。,大多数实验室使用的大肠杆菌包括三种位点特异性的 DNA 甲基化酶,由d
19、am基因（Dam甲基化酶）编码的甲基化酶能将甲基转移到 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位点上（1，2）。 由dcm基因编码的Dcm甲基化酶，能在CCAGG和 CCTGG（1，3）序列内部的胞嘧啶C5 位置上甲基化。EcoKI 甲基化酶，即 M.EcoKI 可将 AAC（N6A）GTGC 和 GCAC（N6A）GTT 上的腺嘌呤进行甲基化修饰。,如果限制性内切酶的识别位点是从表达 Dam或 Dcm 甲基化酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能不被切割。 例如，从 dam+ E.coli 中分离的质粒DNA完全不能被识别序列为
20、GATC的MboI所切割。,解决方法,被Dam或Dcm甲基化的限制性位点可以通过克隆DNA至dam- /dcm- 菌株【如 dam- /dcm- E.coli 感受态细胞（NEB #C2925）】进行去甲基化。,真核生物甲基化,在高等真核生物（如 Dnmt1）中发现的 CpG 甲基转移酶（CpG MTases），将甲基基团转移至胞嘧啶残基上的 C5 位点。 CpG 甲基化形式受遗传因素的影响，具有组织特异性，并与基因表达相关。因此，我们推测CpG甲基化在基因分化和表达中起了一定的作用。 不过，一旦DNA被克隆到宿主菌中，将不存在 CpG 甲基化形式。,酶切位点的分析软件,DNASTAR Primer 5.0,Primer 5.0软件分析酶切位点,DNASTAR 软件分析酶切位点,
