1、血红蛋白的提取和分离,自学提纲：,主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用2.主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理电泳法分离样品的原理缓冲溶液的组成和作用机理,据自学提纲阅读课本66-68页,1. 凝胶色谱法（分配色谱法）,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。,2.分子质量不同的蛋白质通过凝胶色谱柱的时候，怎样分离？,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部通道，路程较长，移动较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动较快，从而分离。,2. 缓冲溶液：,概念：凡是能够抵御外加少量强酸或者强碱的影响使原来溶
2、液pH基本保持不变的混合溶液。,弱酸和弱酸盐： H2CO3NaHCO3 CH3COOHCH3COONa 弱碱和弱碱盐：NH4OHNH4CI,3.电泳：,概念：是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。,原理：样品中各种分子带电性质、分子大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，,常用的电泳方法：,琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳,阅读课本P 67-69，思考下列问题：,1.蛋白质提取和分离的四个步骤分别体现在那些实验操作中？ 2. 血红蛋白有何特点？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？ 3.如何判断血红蛋白分离是否成功？ 4.填装凝胶色谱柱为什么要紧密不能有气泡？,实验操作：,【样品
3、的处理、粗分离、纯化、纯度鉴定】, 1.红细胞洗涤：（目的、低速短时离心、重复洗涤）, 2.血红蛋白的释放：（蒸馏水、甲苯作用）, 3.分离血红蛋白溶液：（分四层）, 4.透析：（目的）, 5.凝胶色谱操作：（制作、填装、样品的加入洗脱）, 6.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：（测定纯度）,若血红蛋白红色区域均匀、狭窄、平整，则分离成功；若血红蛋白红色区域歪曲、散乱、变宽，则不成功。,因含有血色素而呈红色，在样品洗脱时，可通过颜色来判断什么时候收集洗脱液。使操作变得直观、简化了操作步骤。,若填装不紧密、不均匀，有气泡，会形成无效空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,注意事项：,1.红细胞洗涤次数不能过少； 2.离心速度不能过高和时间不能过长； 3.填装凝胶色谱柱不能有气泡，要紧密。,
