1、第十一章 工业微生物菌种复壮与保藏,第一节 菌种的退化与复壮 第二节 工业微生物菌种的保藏,退化的自发性：微生物菌种在传代繁殖中受环境条件的影响，多数情况下会出现退化。退化不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变的过程。 退化的可延缓性：要求菌种永远不退化是不可能的，但积极采取措施，可使菌种优良特性延缓退化。 延缓退化的思路：在了解菌种退化原因后，减少传代，科学保藏，经常纯化分离。 保藏方法通常有两类： 一类保藏时间较短，如琼脂营养斜面等 另一类保藏时间较长，如沙土法等保藏方法的基本原理是抑制菌种的代谢活动，使之停止繁殖，处于休眠状态。,第一节 菌种的退化与复壮,一、菌种退化的定义 生产菌种
2、或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行移接传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。,二、菌种退化的原因 (一) 基因突变 (二) 连续移代 (三) 培养和保藏条件的影响,(一) 基因突变 1. 基因突变导致菌种退化 2. 质粒脱落导致菌种退化,(二) 连续移代,(三) 培养和保藏条件的影响 不良培养条件如营养成分、温度湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发低产基因型菌株的出现，而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化。 培养基条件影响不同类型细胞或细胞核的数量 培养基也会影响菌种形态特征和培养特征 不良的环境，如温度、
3、湿度、pH值、氧气等都会不同程度的引起菌种退化。,三、菌种退化的防止 1. 尽量减少传代：减少自发突变的几率。 2. 菌种经常纯化： 3. 创造良好培养条件：适合原种的生长。 4. 用单核细胞移植传代：孢子。 5. 采用有效的菌种保藏方法：数量性状。,四、菌种的复壮及其方法 (一) 菌种复壮的原理 人们通过人工选择法分离筛选出那些原有优良性状的个体，使菌种获得纯化，这一过程即复壮。 “狭义复壮”：在菌种已发生退化的情况下，通过纯化分离和测定生产性能等方法，从退化群体中找出少数尚未衰退的个体，进一步繁殖，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种消极措施。 “广义复壮”：在菌种的生产性能尚未退化前就经常
4、有意识地进行纯种分离与生产性能的测定工作，以保持菌种稳定的生产性状，甚至使其逐步提高的一种积极措施。,(二) 菌种复壮的主要方法 1. 纯种分离2. 淘汰法：低温处理 3. 宿主体内复壮法：寄生性微生物,第二节 工业微生物菌种的保藏,一、菌种保藏 1. 定义：在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染以便于研究、交换和使用的目的。 2. 菌种保藏方法的共同特点 (1) 挑选典型菌种的优良纯种，最好采用休眠体； (2) 创造一个适合长期休眠的环境条件，如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度调节剂等。,3. 常用的菌种保藏方法 (1) 斜面
5、保藏方法 (2) 液体石蜡保藏法 (3) 干燥保藏法 (4) 冷冻干燥保藏法 (5) 真空干燥法 (6) 液氮超低温保藏法 (7) 液相保藏法,(1) 斜面保藏方法 主要影响因素： A. 菌种保藏培养基 a. 营养成分贫乏，氮源略多，而糖类少； b.培养基交替：保藏斜面在传代过程中，营养贫乏和丰富培养基交替使用，有利于保持菌种的优良特性； c.碳、氮源：配制斜面保藏培养基时，要选择那些不易引起菌种回复突变的碳、氮源； d. 斜面保藏培养基最好用植物等天然有机物浸出汁配制，有利于保持菌种活性。 B. 培养条件,优点 简便有效，特别适合于非长期保藏的菌种以及不能采用低温干燥方法保藏的菌种。 缺点
6、A.存在自发突变：由于斜面含有营养和水分，菌种生长繁殖未完全停止，代谢活动仍微弱进行。 B. 移植代数多：比其他保藏方法多，易发生变异和引起退化； C. 传代频繁：不仅影响菌种质量，也容易造成杂菌污染； D. 水分蒸发：造成浓度增高，渗透压加大，易引起菌种退化甚至死亡。,(1) 斜面保藏方法,(2) 液体石蜡保藏法 其实是斜面保藏的一种方式，它比斜面保藏的好处是因为在斜面中加入石蜡油，保存期间可以防止培养基水分蒸发并隔绝氧气，克服了斜面保藏的缺点。,(3) 干燥保藏法 自然界中不少微生物由于可产生孢子或芽孢，在干燥环境中抵抗力强，不易死亡，因此把菌种接种到一些适宜的载体上，人为创造干燥环境，能
7、够达到菌种保藏的目的。 常用干燥保藏方式 砂土保藏法 滤纸条保藏法 无水硅胶保藏法 麸皮保藏法,(4) 冷冻干燥保藏法 用保护剂制备菌悬液，然后将含菌样快速降至冰冻状态，减压抽真空，使冰升华成水蒸气排出，从而使含菌样脱水干燥，并在真空状态密封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境，置于低温保存。,(5) 真空干燥法 (6) 液氮超低温保藏法 (7) 液相保藏法 A. 蒸馏水保藏法 B. 磷酸盐缓冲液保藏法 C. 食盐溶液保藏法,二、菌种保藏注意事项 1. 保藏菌种要用良好的培养基，采用新鲜培养的菌种； 2. 操作中应严格无菌操作； 3. 注意保藏菌种的制备质量 4. 为防止菌种退化，应创造最适宜的保藏条件； 5. 严格控制传代次数； 6. 恢复培养时，应移接到保藏前相同培养基上进行培养，以维持优良性能的稳定性。,工业微生物育种学 总结,主要内容,定向培育与选种,诱变育种,杂交育种,代谢控制育种,基因工程育种,原理,基因突变,诱发突变,遗传、生长,代谢控制,基因体外重组,方法,分离、出发菌株,诱变、杂交,筛选,保藏,重点,诱变机制与诱变剂种类,代谢类型与代谢调控机制,杂交原理与方式,分离与筛选、鉴定方法,
