1、 实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。实验原理：利用重组技术将探针蛋白与 GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过 GST 与固相化在载体上的 GTH（Glutathione ）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离.试剂：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck 分装) ，PMSF（Amersco） ，Cocktaier （Merck 539134） ，Immobili
2、zed Glutathione（PIERCE 15160）实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与 GST 融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS 及 PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl： 8gKCl： 0.2gNa2HPO4： 1.44gKH2PO4： 0.24g加入 800ml 蒸馏水，用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.4，最后加蒸馏水定容至 1L 即可，高温高压灭菌！4保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度 0.1-1mM，这里使用 1mM，储存浓度100mM，将 0.174g PMSF 溶于 10
3、ml 无水乙醇混匀即可！保持于 -20或者 4（以下流程仅供研究已知原核蛋白 A 和真核过表达蛋白 B 相互作用）1：原核融合蛋白 A 的获得1.1：将编码蛋白 A 与 GST 的重组质粒化转 BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有 5mlLB(+100ug/mlAmp)的 10ml 试管里，37培养过夜1.3：将培养菌液转移到含有 500ml LB(+100ug/mlAmp)的 1L 锥形瓶中，37，225rpm 培养至 OD6001.0-1.5左右，加入适当浓度的 IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整）.6000g，10 分钟，4离心收集细菌，去尽
4、上清，将菌体至于-20放置 O/N1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每 500ml 培养液加入 10-20ml 细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF） ，吹打混匀1.5：冰上超声破碎，开 2 秒，停 9 秒，总 40-60 分钟。至裂解液充分清凉1.6：11000rpm，15 分钟，4离心分离上清， -80保存备用2：真核融合蛋白 B 的获得2.1：将编码 B 蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如 HA,或者 myc）的真核表达载体上，进行细胞转染 xq3：48 小时后，取适量融合蛋白 GST-A 冰上冻融4：取 50-70ulGST-Beads（Immobilized G
5、lutathione）到 EP 管中，用 800ul PBS+1%Triton-100 润洗一次，将冻融融合蛋白 GST-A 与之混匀，4层析柜旋转结合 1 小时。5：PBS+1%Triton-100 洗 3 次， PBS 洗 3 次。留取 20ul（ PBS+Beads）作 Offer。6：同时，裂解真核融合蛋白 B，去尽培养基，用 PBS(RT)洗一次，加入 300ul 裂解液（以6well 为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier ） ，4放置 30 分钟。7：吹打收集至 1.5mlEP 管，超声破碎。13000rpm，15 分钟，4离心取上清。8：BCA 蛋白定量（
6、optional）留取 20ul 做 Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的 EP 管中，用 PBS 补足液体到 600ul 左右，以便蛋白之间能充分结合！4旋转结合O/N9：PBS+1%Triton-100 洗 3 次，PBS 洗 3 次。10：40ul 5loading buffer 溶解 beads 上的蛋白，煮沸 3 分钟，高速离心，Run SDS PAGE做 Western Blot 检测。用 HA 或者 myc Blot。 注意 GST-pull down 的对照问题。 （以 A-GST 和 B-6*His 为例）1. 跑 SDS-PAGE 时点一个 input 的蛋白（即 B-6*His）用于做阳性对照 看一下 western 操作过程中，试剂，操作步骤有没有问题。2. 谷胱甘肽琼脂珠上只固定 GST 蛋白，input B-6*His，用于做阴性对照 看一下是否 GST会与 input 的蛋白相互作用
