1、长片段非编码 RNA 在肿瘤领域的研究进展人类基因组研究显示仅有约 20000 个蛋白编码基因，占总的基因组序列不到 2%1,2。 然而 90% 的基因组序列都处在活跃转录中 3,4。研究者发现人类转录组不仅仅是蛋白编码基因及其剪接变异体的简单组合，还存在广泛的转录反义 RNA、重叠 RNA 和非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA）的基因5-10。这些最初被认为是基因组中的“暗物质” ，近期研究显示在细胞发育和代谢中发挥重要的作用11-17。新近发现的长链非编码 RNA（ long non-coding RNA，lncRNA)基因就是其中备受关注的一种，lncRNA 的表达
2、具有时空特异性，其异常调控广泛见于包括癌症在内的多种疾病。ncRNA可以根据其长短简单分为短链非编码RNA（small ncRNA） （18-200nt）和lncRNA（200nt-100kb以上） 。Small ncRNA包括我们熟知的miRNA，以及新近发现的转录起始RNA（transcription initiation RNAs，tiRNAs）等。lncRNA像mRNA一样由RNA聚合酶生成，并且在平均长度及多聚A尾和多聚A尾信号所占的百分比等方面都与mRNA分子有很大的相似之处，但是它们缺乏长的进化保守的开放阅读框，没有编码蛋白质的功能47,48。通常而言，lncRNA基因的表达水平
3、要低于蛋白编码基因52-55, 而某些lncRNAs特定地表达在某些组织中21。然而,近期研究显示新发现的lncRNAs可能是前面提到的转录组“暗物质”中的重要组成部分56,57。与miRNA和蛋白编码基因，某些转录活跃的lncRNA存在5末端三甲基化的组蛋白H3K4 和基因主体部分的三甲基化的组蛋白H3K368,58,59。目前发现的少量人类lncRNAs 参与了一系列的生物过程，包括表观遗传学调控，选择性剪切，入核转运，作为结构元件，作为小RNA前体，甚至作为mRNA衰变的调控子等4,60-70。更重要的是越来越多的研究表明lncRNA的异常调控广泛参与了多种人类疾病，包括肿瘤的发生和发展
4、。一、 lncRNA与肿瘤的发生、发展研究者在lncRNA发现初期即提出肿瘤组织与正常组织中lncRNAs的表达存在差异的猜想，但一直缺乏有力的证据86。 随着肿瘤转录组以及lncRNAs功能学的进展，目前已发现一系列在肿瘤中差异表达的lncRNAs。lncRNA参与调控多种生物功能，这些功能如基因组印迹和转录调控的异常在肿瘤发生中发挥重要的作用。在此，我们重点介绍研究较清楚的与肿瘤生物相关的一些lncRNAs。印迹 lncRNA基因印迹是指来自父母一方的基因备份被转录后沉默87,88。癌症的一个重要特点是由于印迹的丢失导致了基因表达的改变90,91。而其中最为人所知的基因实际上均为lncRN
5、As。H19基因编码了一个仅表达在母体等位基因的长2.3kb的lncRNA。H19在脊椎动物胚胎发育期高表达，而出生后在除了骨骼和软骨组织外的大部分组织中表达明显下降20,93,94。在人类肿瘤中，印迹的丢失和随后的基因高表达现象十分常见。例如，H19位点印迹的丢失导致H19表达的上调广泛见于食管癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌及肝脏转移瘤中95-97。H19在不同癌症中显示致癌或抑癌作用。H19在肝癌，膀胱癌和乳腺癌中均高表达，提示其致癌作用97-99。在结肠癌中，原癌基因转录因子c-Myc直接激活H19，提示H19直接参与c-Myc对下游基因表达的调控98。相反，抑癌基因和转录激活因子p53能下调
6、H19的表达100,101。有趣的是，也有研究显示H19同样具有肿瘤抑制作用104,105。Xist(X chromosome inactive specific transcript)RNA，长约16500nt，能并同X染色体一起移动，改变染色体的结构和活性，抑制相应的基因转录，从而使x染色体失活106。XIST的表达水平与某些肿瘤的预后密切相关，如卵巢癌的治疗反应118, 但XIST在人类肿瘤的发生中的作用还未明确。肿瘤转移HOTAIR是一个位于人类12q13.13染色体哺乳动物HOXC位点的长2.2 kb的基因，其编码的lncRNA是最早发现与肿瘤转移相关的lncRNA 之一18。HOT
7、AIR RNA在原发和转移乳腺癌中均高表达（高出正常组织2000 倍以上）68。高表达的HOTAIR与肿瘤侵袭、转移和患者预后不良密切相关68 。如将表达HOTAIR的细胞种植到小鼠乳腺脂肪垫中,会一定程度加快原发肿瘤的生长 68.有趣的是，从HOX位点中能转录出多个lncRNAs, 提示HOTAIR可能只是这一个调控现象的其中一个已知的lncRNA，可能还有多个lncRNAs发挥类似的作用 58。MALAT1 RNA是一个位于人类1lql3染色体上，长约8600bp的lncRNA，它可通过与其他分子(如转录因子等)相结合而发挥基因调控作用。 Lin等119研究发现MALAT1与肝癌的发生、发
8、展密切相关。在肝细胞型肝癌中其表达量是正常肝脏的6倍，同时该转录子在肝细胞型肝癌发展的各个阶段，包括早期阶段，均有显著的表达增加，而且在其他非肝细胞型肝癌中也有类似的差异表达。通过原位杂交技术又发现在5080的乳腺癌、胰腺癌、结肠癌以及25的前列腺癌组织中均有MALAT1的高表达，而在对照的正常组织中却仅有低表达或没有表达。另外，Ji等120发现相对于非转移性的非小细胞肺癌，转移性非小细胞肺癌中MALATl的表达更多。Yamada等121报道在子宫内膜间质肉瘤中有比正常的子宫内膜更多的MALAT1的表达。因而，MALAT1可能是一个潜在的广谱的人类肿瘤标志物。通过激活 p53介导肿瘤抑制作用M
9、EG3是最早报道的具有肿瘤抑制作用的lncRNA。MEG3基因表达与人类多种正常组织中，而在脑和垂体组织中表达最高156,157。MEG3在脑肿瘤及大多数肿瘤细胞系中均不能检出，提示其具有肿瘤抑制作用。更重要的是，过表达MEG3 RNA能抑制多种肿瘤细胞系的增殖，进一步支持MEG3的肿瘤抑制作用157。在非功能性的垂体瘤中，MEG3调控区域的超甲基化与MEG3的失活有关，为MEG3的失活提供了直接证据157。功能上，MEG3是有关高水平的调控性RNA，因为它能激活P53依赖性和非依赖性途径。MEG3介导的p53激活依赖于MEG3 RNA的二级结构而不是一级结构158。相反，新发现的lncRNA
10、-p21被认为是p53转录反应的下游抑制子，提示p53转录网络包含了多个lncRNAs164。通过诱饵或 miRNA海绵作用清除 miRNA拷贝数改变和转录后沉默等机制会导致肿瘤miRNA表达的异常165-168。两个新发现的lncRNAs被认为能通过自然miRNA海绵（naturalmiRNA sponges ）作用降低miRNA表达水平。HULC基因位于6p24.3染色体上,其编码的lncRNA具有典型的mRNA特点。尽管HULC与核糖体共同纯化，却没有任何翻译产物，因此它属于非编码转录子170。除了肝癌以外，HULC在结直肠癌肝脏转移瘤和产乙型肝炎病毒的肝细胞癌细胞系均高表达171。最近
11、研究初步揭示肝癌细胞HULC高表达及其作用的机制172。HULC是复杂的自主调控网络的一部分，该网络调控异常会导致HULC表达的上调HULC RNA可能是通过分子诱饵（molecular decoy）或miRNA海绵（miRNA sponge）作用清除miR-372。miR-372能转录抑制作用于cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的一种激酶PRKACB。CREB一旦激活，CREB能通过维持HULC启动子区域的一个开放读码框架促进HULC的转录172。假基因对（ Pseudogene pairs） PTEN和 PTENP1抑癌基因PTEN及其相应的lncRNAPTEN假基因1（PTENP1）的
12、相互作用机制类似于HULC RNA 173。PTEN/PTENP1的转录子具有类似的3非翻译区（UTRs） ，使两者均结合于相同的miRNAs。通过结合于miRNAs，PTENP1能减少miRNAs对PTEN的抑制作用而上调其表达。在癌症中，特异性突变使PTENP1的miRNA结合位点失活将减少抑癌基因PTEN的转录，从而促进肿瘤细胞的增殖173。这种机制有重要的意义，因为PTEN1水平的轻微改变即可影响癌症的易感性173。介导肿瘤抑制因子的异常表达ANRIL基因位于人类9p21.3染色体上，是42kb的INK4b-ARF-INK4a位点的一部分。ANRIL是由RNA多聚酶II 转录，并被剪切
13、成不同的异型体，包括一个名为p15AS的长34.8kb的非剪切转录子175,176。ANRIL的异常表达及单核苷酸多态性与包括癌症在内的多种疾病发生的易感性关系密切181,182。在白血病、黑色素瘤、肺癌和膀胱癌中，INK4b-ARF-INK4a位点容易发生高频突变和超甲基化181。 研究显示ANRIL能够转录后沉默抑癌基因p15，尽管其机制尚未完全清楚175。癌症类型特异性表达尽管上述大部分lncRNAs均在多种人类组织中表达，但有极少数lncRNAs到目前为止只发现表达于某种组织中。例如HOTAIR只在乳腺癌表达，而lncRNAs PCGEM1,DD3和PCNCR1仅与前列腺癌有关68,1
14、86,187。其次，肝脏相关性lncRNAsHULC仅高表达于原发性肝细胞癌和结直肠癌肝转移瘤中，而不在原发性结直肠癌或非肝转移瘤表达171。RNA多聚酶 III转录到目前为止，上述lncRNAs均由RNA多聚酶II转录,但仍然有很多ncRNAs是由RNA 多聚酶III（RNA pol III）转录191。重要的是RNA pol III在癌症细胞常常异常调控而导致其活性的增加192,193。促使肿瘤细胞中RNA pol III活性增加的机制包括RNA pol III转录因子的高表达，RNA pol III抑制子逃避和直接的原癌基因激活193-195。RNA pol III功能异常会影响由此多聚
15、酶转录的lncRNAs的表达。例如，BC200是灵长类神经系统神经元及人类非神经元癌症细胞的胞浆内的lncRNA20,50,51,196,197。与上面我们提到的lncRNAs不同的是，BC200是由RNA pol III所转录，并与人类Alu元件有独特的同源性。BC200是eIF4A依赖性翻译启动的负性调控子199。由于大部分全转录组测序均应用富集多聚A纯化转录子的方法，RNA pol III转录子可能会从这些分析中排除。这提示，其他尚未确定的RNA pol III转录的lncRNAs在恶性肿瘤中的高表达可能参与了肿瘤的发生。二、 lncRNA在癌症诊断和治疗的应用与非编码的miRNA一样，
16、lncRNAs 是具有广阔的疾病诊断和治疗应用前景。在某种癌症中特异性表达的lncRNAs 的差异表达或高表达可用以开发新型的肿瘤标志物，这些lncRNAs 可能与病人对化疗的敏感性密切相关。加深对lncRNAs 作用机制的理解将提供调控基因表达的新方法，例如开发与miRNA结合位点竞争的类似物，染色质重塑因子或DNA。研究者指出介导转录基因沉默（transcriptional gene silencing， TGS）途径，尤其是抑癌基因和原癌基因TGS途径有可能为开发新型治疗方法的提供新的思路205。三、 结语最近的研究表明，一些长片段ucRNA的高表达或低表达与某些肿瘤的发生、发展有关。然
17、而研究尚处于初级阶段，利用长片段ncRNA进行肿瘤的诊断和治疗还有许多尚未解决的问题。在诊断方面，如何确定不同临床分期的特征性长片段ncRNA谱，以达到早期诊断的目的；如何确定不同病理类型的特征性长片段ncRNA谱，以达到病理分型的目的；如何寻找无创手段进行检测等。在治疗方面，如何设计持续高效表达的载体；如何有效导入至活体内；如何在特定组织或器官持续表达等都是亟待解决的问题。相信随着长片段ncRNA研究技术的发展，在不久的将来长片段ncRNA会为肿瘤的诊治带来突破性的进展。References1. Stein LD: Human genome: end of the beginning. Na
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