1、第二部分 DNA 重组的载体载体的三大功能：1）为 外源基因 提供进入 受体细胞的 转移能力。2）为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合能力。3）为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。,理想载体具备四个条件： 1）具有 对受体细胞的 可转移性，提高导入细胞的效率。2) 具有与特定受体细胞相适应的 复制位点 或整合位点，使外源基因在受体细胞中 稳定遗传。具有 多种单一的核酸内切酶识别 切割位点，有利于 外 源基因的 拼接插入。4 ) 具有合适的选择标记（报告基因），便于DNA重组分子的检测。,一质粒载体 (Plasmid)1质粒的基本特性1）自主复制性。具有自己的复制起始位点 (Ori
2、ging)(ori) 和控制复制频率的 控制基因 及编码基因，形成 独立复制子 (Replico) 结构。,2）可扩增性。 严紧型复制质粒 (Stringent)由宿主细胞内聚合酶III介导，为质粒上编码的蛋白因子正调控，蛋白因子极不稳定，每个细胞复制1-5个质粒拷贝。 松弛型复制质粒 ( Relaxed)质粒复制需要半衰期长的聚合酶I；聚合酶，以及辅助的蛋白因子参与，合成减弱或完全中断时，质粒复制持续进行，具有高拷贝数30-50个。, 当加入氯霉素抑制蛋白质生物合成，阻断宿主菌代谢途， 而松弛型复制质粒利用丰富原料及能量大量复制，每个细胞积累上千个DNA分子。这个过程依赖质粒上基因产物与蛋白
3、因子相互作用。3) 可转移性在天然条件下，野生型质粒通过细菌接合作用从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。,4） 不相容性相同 或 相似 复制子结构及特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内， 这种现象称质粒的不相容性。a) 两种不同质粒同时进入受体细胞，两者复制的起始频率随机.b) 分裂前夕的拷贝数不均等，经过若干次细胞分裂后必然导致， 两种不同质粒的独占性。选择标记的插入失活,插入失活,2质粒的改造与构建 1）删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段装载量。 2）灭活某些质粒的编码基因。 3）加入易于识别的选择标记基因。 4）选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序
4、列-多克隆接头. (Polylinker) 5） 加 入特殊的基因表达调控元件。 载体的质粒构建过程 图3-1，图3-2,金属硫蛋白突变体基因 -在蓝藻中克隆一简介 1- 小鼠金属硫蛋白突变体 结构域 二聚体-，对重金 属有强结合能力。2PpSbA 强启动子，在叶绿体，大肠杆菌，蓝藻中强启动功能3pRL- 中间载体，突变体与强启动子相连.4PDC- 穿梭表达载体， 5PCC7120 鱼星藻目的： 构建穿梭表达载体，含有强启动子，金属硫蛋白突变体基因，在蓝藻中表达。表明： 转基因藻具有吸附金属的能力。,穿梭表达载体的构建1 人工合成两引物， 5-GA GAATT CATTCATGTGCTGCTC
5、CTGCTGCTGT-3BamH l5-CT GGATC CTCAGGCACAGCAAGTGCAiGCA-3E.coR1与 PG2A 进行 PCR，得到突变体基因，两端含有E.coR 1 和 BamH 1 双酶切位点。,2. RL-439 中间质粒。被 E.COR I 和 BamH I 双酶切. (12)两者 T4-连接酶 连接，-基因 定向克隆到 强动 子 PpSbA 之后. 4. PpSbA强启动子，在叶绿体，大肠杆菌，蓝藻强启动功能 5. 穿梭表达载体的获得 1) 中间载体 PRI-, 穿梭表达载体 pDC-08 用EcoRI 酶切 2) T4-DNasa 相连, 3) 用 EcoRI
6、酶切载体, 鉴定。,6. 三亲结合转移与筛选， 7. 转化子鉴定。 8. 蛋白质印迹鉴定.,图1 愈伤组织小块接种于不同比例的激素中，待分化。,图2 愈伤组织已长成。,3质粒的分类及用途1）克隆质粒： 用于克隆和扩增外源基因。2） 测序质粒： a) 高拷贝复制，便于DNA片段克隆和扩增。b) 含多酶切口的接头片段，在接头片段两端邻近区域，设有两个不同的引物序列，重组质粒变性后即可测序。3） 整合质粒：含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列，克隆在整合质粒上的外源基因进入受体细胞后，准确重组整合在染色体 的特定位置上。,4）穿梭质粒a) 分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构及相应选择标记基因，
7、因此能在两种不同种属的受体中复制并检测。大肠杆菌-链酶素穿梭质粒，大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒。b) 克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载体直接从一个受体菌转移至另一个受体菌中复制并遗传。,5）探针质粒a) 设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子，终止子。b) 装有定量检测表达程度的报告基因，（抗生素的抗性基因）c) 缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因d) 当含有启动子，终止子的DNA片段插入合适的位点，报告基因才能表达。e) 表达量的大小直接反应被克隆基因的表达调控元件的强弱。,6）表达质粒 a) 在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启动 子，合适的核糖体结合位点（
8、SD 序列），终止子结构。使得克隆在合适位点上的任何外源基因都可在受体细胞中,高效表达。大肠杆菌常用启动子：Lac, Tac, Trp,和来自噬菌体强启动子 PL, PR 。它们 由大肠杆菌 RNA 聚合酶 识别 起始.,来自 T7 噬菌体的 T7 启动子。必须由 T7 噬菌体来源 T7 RNA聚合酶 识别 起始转录。d) 表达载体用 T7 启动子必须用能产生 T7 RNA 聚合酶的受体菌株 JM109 , BL21(DE3)。e) PSPORT 系列和 pSP 系列。,4. 实验室常用大肠杆菌载体 质粒 大小(Kb) 选择标记 克隆位点 功能 pBR322 4.36 Ap,Tc BamHI,
9、PstI,EcoRI 克隆载体pGEX 4.9 Ap,Lac PstI,MluI, EcoRV 次级克隆载体Ap,Iac, NarV 酶解作标准分子量pKK233-2 4.6 Ap,Tc SalI, BamHI, 表达型NcoI位点提供PstI, NcoI ,EcoRI 翻译启始密码子pSP72 2.6 Ap XhoI, PstI, BamHI 表达型,携有- HidIII EcoRV 双向T7,Sp6启动子pSPORT1 4.11 Ap, Lacopz EcoRI ,SalI, Pst 表达型携有BamHI ,HidIII 双向T7,Sp6启动子pUC18/19 2.69 Ap,Lacz E
10、coRI, HidIII 测序载体,KpnI ,BamHI 次级克隆载体,5.,质粒的纯化1. 碱裂解法a) 溶菌酶 破细胞壁； b) SDS-NaOH 混合液 去细胞膜，释放细胞内含物 ； c) 高浓度 醋酸钾 沉淀染色体，去除染色体 DNA和 蛋白质；d) 苯酚-氯仿灭活核酸酶，去除蛋白质；e) 乙醇沉淀水相质粒；f ) 用 Rnase 降解 RNA。优点：质粒纯净 。 缺点：存在一定比例开环结构。,2. 沸水法 a) 用牙签挑取固体培养基的菌体， b) 悬浮在 EDTA, Triton-100, 溶菌酶缓冲液 ， c) 沸水中 30-40s ， d) 离心，挑去沉淀物 ， e) 乙醇沉淀
11、水相 质粒 DNA。优点：速度快200个克隆/每天 ， 缺点：纯度不高。 3. 由于空间结构不同，电泳条件下迁移率顺序:cccDNA L-DNA OC-DNA D-DNA T-DNA经限制性内切酶处理，所有结构都为直线性分子。,电泳方向 V| T-DNA - | D-DNA -| OC-DNA - V L-DNA - -Ccc-DNA -对照 酶切质粒 DNA 酶切图谱示意,图 2-4 DNA 酶解后的电泳图谱1 2 3 4 5 6 7,3. 氯化铯密度梯度离心法 氯化铯 EtBr（溴化乙啶）a) 细菌裂解及分离过程中染色体易断裂为线性分子b)质粒DNA分子量小，结构紧密，保持环状。c) 溴化
12、乙啶插入 线性 DNA 多，密度低。 石蜡油层 蛋白质 缺口环状和线性DNA 闭环质粒DNA RNA,二入-双链 噬菌体 入- 噬菌体生物学特性： 是大肠杆菌温和型 噬菌体，由头部外壳蛋白和 48.5 kb 双链DNA 组成，入- DNA两端各有一个12 碱基 组成互补单链,称cos末端，cos 末端将 DNA 引入头部结构。 大肠杆菌 宿主细胞裂解释放 噬菌体颗粒，噬菌体 颗粒又感染附近大肠杆菌,形成新一轮裂解周期，入- 噬菌体 悬浮液加到大 肠杆菌液体培养基，37C 培养 6小时，培养液由 混浊变 澄清，说明大肠杆菌完全被裂解。,噬菌斑A. 入- 噬菌体 悬浮液 加到 大肠杆菌，和琼脂糖
13、固体 培养基， 37C 过夜。B. 固体平板培养基 出现 透明斑点（噬菌斑）.噬菌斑是 经过若干裂解周期 形成 宿主菌死亡区域。同体培养基限制，透明圈外围大肠杆菌 仍能生长.一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒，均由一个噬菌体无性繁殖所产生的，是入- 噬菌体 DNA 用于分子克隆的基本原理。,三入-双链 噬菌体 载体入-DNA 通过噬菌体特异性感染高效进入宿主细胞或受体 细胞，b) 入-DNA在大肠杆菌中高拷贝复制，c) 噬菌体的头部空壳蛋白对 入DNA 的包装与其序列无关,只 识别COS位点。d) 在分子克隆早期就被选作载体使用。,1重组体分子的体外包装 1）把带有目的基因的外源片段插入载体，导
14、入寄主细胞。直接感染大肠杆菌，转染 （transfection） 形成 噬菌斑。2）体外包装，把重组体分子包装为成熟的噬菌体颗粒，再导入寄主细胞。,3）入-DNA 包装 入-噬菌体 头部前体结构a) 头部空壳蛋白可包装最大限度 51 Kb,大于 51 Kb 头部包装 不进去，最小限度 38 Kb，小于 38 Kb 噬菌体颗粒无侵染性。包装限度是 入-DNA 总长的 75%-105% (38 Kb，51 Kb)b) 野生野生型 入DNA 长度为 48 Kb，其中 40%， 约20 Kb 对 整合，切割极其重要。 c) 野生型 入DNA 基因组中编码必要基因的 DNA 区段约 占20 Kb.d)
15、带目的基因的外源片段 入DNA 载体极限约 23 Kb.,2野生型 入DNA 载体的构建1） 缩短长度，提高外源 DNA 片段的 有效装载。入DNA 中部重组整合区占 入DNA 的 40% （ 19.4 Kb），缺失不影响 入DNA 复制与裂解周期，可重组改造。改造后带目的基因的外源片段 入DNA 载体极限 23 Kb2）删除重复的酶切位点。a) 野生型 入DNA 有重复酶切位点，5个EcoRI，7个HidIII.b) 引入多酶切口接头。,3）灭活与裂解周期有关基因。a) 野生型 入DNA 经改造后在所有大肠杆菌内进行繁殖，极易扩散传播，重组体分子的性质，对生物体或人才类带来危害。将无义突变引
16、入裂解周期有关基因内，这种 入DNA在的少数 大肠杆菌菌株中繁殖（K12）大肠杆菌 K12 在蛋白质合成时 纠正无义突变。,4）引入 选择标记 基因。LacZ，（基因片段来自大肠杆菌）a) 蓝色噬菌斑入DNA载体编码 -半乳糖苷酶N端前146个氨基酸与大肠杆菌宿主 表达的 -半乳糖苷酶 C 端 肽段互补（-互补）形成全酶，酶将5-溴-4-氯-3-吲哚-D -半乳糖苷（X-gal)降解,成为蓝色产物, 淡蓝色噬菌斑。b) 无色噬菌斑重组外源基因插入后将酶灭活，重组噬菌体形成无色噬菌斑。,CI+标记基因， 溶源状态，混浊噬菌斑透明（重组）。CI+ 基因编码 CI 阻遏蛋白，CI 基因突变的入-噬菌
17、体形成透明 噬菌斑。a. 入DNA 载体携带含有 EcoRI 切点的 CI+ 标记基因，b. 这种载体进入高频溶源化突变的大肠杆菌内，建立溶源状态，形成混浊噬菌斑,(溶源细胞比未感染的细胞生长慢）c. 当外源基因插入到 CI+标记基因 EcoRI位点时，导致CI+ 基 因灭活，重组噬菌体，因不能建立溶源状态而形成 透明噬菌斑。,Spi+ (P2干扰敏感性 )，1. 野生型 入 噬菌体 在 P2 噬菌体溶源化的大肠杆菌中不能进入裂解周期，称干扰敏感性。（不形成噬菌斑）但缺失重组基因 red, gam 的入 噬菌体 在P2 噬菌体溶源化 的大肠杆菌将不受影响，裂解溶源菌正常繁殖而形成噬菌斑。3.
18、外源重组基因插入与载体某一片段缺失同时发生缺失片段含有red, gam基因. （即red, gam基因缺失）凡是重组 入 噬菌体 呈现 Spi 表型 即裂解溶源菌形成噬菌斑,2入DNA 分类 及 用途a) 插入型载体：改造后 入DNA 载体长度正好为包装下限，称插入型载体。允许 外源DNA 插入片段 0-14.5Kb。b) 取代型载体: 入DNA 长度 40Kb，在非必需区含两个相同酶切口，之间距离 14Kb，去除这 14Kb 用外源DNA片段取而代之。 1) Charon 系列设计克隆外源 DNA 大片段的 取代型载体,2) EMBL 系列设计克隆外源 DNA大片段 的 取代型载体。优点：便
19、于将外源DNA片段从重组体分子上切下。 3) 入-DASH 系列含有 方向互为相反 的两套多 克隆位点接头序列，优点: 便于多种 外源 DNA大片段的 取代重组。 4) 入-gt 系列插入型表达 载体可用来克隆表达外源 c-DNA，优点: 载体上温度敏感型阻遏物, 用来控制复制及融合蛋白的表达。,3入DNA 的纯化含有 乳糖和 MgCI 的 LB 培养基上培养 大肠杆菌，至 对数生长期。 2) 加入合适滴度 入-DNA 噬菌体悬浮液，（已包装好含外源DNA），37 1h。 新鲜 LB 培养基 稀释培养物。培养 4-12 h ，噬菌体颗粒达 1013 /L-1014 /L。4. 加入固体 NaC
20、I 和 PEG -800，高速离心沉淀 噬菌体颗粒 5 . 蛋白酶K 处理 噬菌体悬浮液，苯酚-氯仿 抽提，释放入DNA。6. 乙醇沉淀DNA。,此法抽提 入DNA 纯度不高，含染色体DNA，程序简单。第4）改用 CsCI 密度梯度离心, 获得高纯 入DNA 样品。 三. M13 单链 噬菌体 载体1. 单链 环状 性丝状 噬菌体，特异性感染 含性散毛结构的大肠杆菌。2. M13DNA 所有基因都是 必需的，不能删除。,3. 通过 定点诱变，插入片段进行改造。1）通过定点诱变，封闭重复酶切切口。2）引入选择标记基因：启动子，操作子，-半乳糖苷酶氨基 端编码序列（LacZ ）的操纵子片段（Lac
21、 ）组氨酸（his ），抗生素抗性基因3）人工合成多克隆位点接头片段插入标记基因内部，含重组 子 噬菌斑呈白色，含载体 DNA 的 噬菌斑 呈蓝色。 4）多克隆位点 接头片段两侧改为统一测序引物序列，分离 的重组分子的单链形式直接用于测序。,四噬菌体-质粒杂合载体噬菌体特征区域与质粒重组，具有优良性能。1考斯质粒 （Cosmid） 1) 入-DNA的 cos 区与质粒 DNA 重组， 2) 入-DNA 装载量 23Kb ，3) 入-DNA 包装蛋白识别 cos 信号，与包装性质无关，用质粒取代 入-DNA，大幅度提高外源DNA装载量。4) 入-DNA-cos 位点及附近区域 1.7 Kb 质粒
22、 3.3Kb。构成 考斯 质粒共 5Kb,5) 最大装载量 45.9 Kb（50.9-5 Kb）。,2. 噬菌粒载体丝状噬菌体 DNA 复制起始点序列与质粒 组成杂合子。1）具有质粒基本性质，便于外源 DNA 克隆及筛选。2）提高外源DNA装载量，一般载体分子小其装载量大。3）M13DNA 重组分子在复制时易发生 DNA 缺失，噬菌粒重组分子则相对稳定。4）常使用的噬菌粒载体pGEM-3Zf 3.2Kb pUC118/pUC119 3.2KbpZ258 4.9 Kb pEMBL 4.0 Kb,五动物病毒载体1特点：向 真核细胞 运载目的基因，动物病毒是理想基因工程载 体。1）整合性感染是病毒核
23、酸整合到细胞染色体上，随复制而扩增。2）序列中具有很强启动子，病毒感染细胞有大量拷贝高效表达3）在感染细胞中提取病毒 比细菌中提取质粒更好。,2 .杆状病毒载体（ AcMNPV 裂解病毒）是昆虫表达系统。1）杆状病毒表达体系用于真核细胞内蛋白质修饰，加工，转运. 2) AcMNPV 是非辅助性病毒。3) 使产物呈溶解状态。4) 基因很大（130Kb），克隆大片段的外源基因。5) 不感染脊椎动物，启动子在哺乳动物细胞内无活性。6) 用于毒性 蛋白质，癌基因表达，优越，可靠。缺点：昆虫细胞培养周期长，技术较难掌握。,3. 痘苗病毒载体痘苗病毒 ( Poxvirus) 是动物病毒中最大一类 痘病毒。
24、 载体三个成分： 1. 调控序列， 2. 可插入外源基因限制性内切酶位点， 3. 胸腺嘧啶核苷激酶基因（tK) 作用：痘苗病毒是高效活疫苗，它的DNA作为载体插入一或几种外源基因，构建多价疫苗株，同时预防几种致病微生物引起传染病。,3. 痘苗病毒载体痘苗病毒 ( Poxvirus)1） 基因组庞大，双链，线状，187 Kb，2） 其中28 Kb区域病毒非必需区，可切除，取代外源基因。3） 外源基因插入痘苗病毒中，重组痘苗病毒仍能正常复制。4） 易于培养，高度稳定，在哺乳动物体内良好复制。 5） 应用痘苗病毒载体插入，表达外源基因，诱发抗体。 现已有：乙型肝炎表面抗原基因，流感病毒血凝素基因，
25、狂犬病毒表面糖蛋白基因，单纯疱疹病毒，EB病毒，水疱性口炎病毒，伪狂犬病毒等有关基因。牛痘苗病毒载体插入艾滋病基因，产生艾滋病抗体。,4. SV40 病毒载体 （表达真核基因使用哺乳动物表达体系）猴病毒40 (Simian virus 40)共价，闭环，双链，长5.2 Kb， 5243个碱基对，功能分为：早期转录，晚期转录。1）早期转录，贯穿整个裂解循环，mRNA表达T抗原和t抗原。T抗原对DNA复制，起始十分重要。t抗原，作用不清。2）晚期转录, 发生DNA复制后，表达 VP1, VP2, VP3是 病毒的 衣壳蛋白。三个蛋白合成后与新复制病毒 DNA 装配成病毒颗粒，病毒由细胞释出，细胞死亡。,3）如向 SV40 插入外源基因，除去某些区段，早期基因 被置换时不合成 T 抗原，晚期基因被置换时不合成衣壳蛋白。 4）需要另外补充 cos 细胞，cos 细胞被转化的猴传代细胞,在其染色体内的 SV40 DNA 能编码T抗原，将重组基因导入 cos 细胞,可形成含有重组基因的病毒颗粒。 5 RNA 病毒 载体 六植物细胞 载体,
