1、1附件：体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则（征求意见稿）2目 录1.体外诊断试剂分析性能评估指导原则编制说明2.体外诊断试剂分析性能评估指导原则检测限3.体外诊断试剂分析性能评估指导原则线性范围4.体外诊断试剂分析性能评估指导原则可报告范围5.体外诊断试剂分析性能评估指导原则准确度（回收实验）6.体外诊断试剂分析性能评估指导原则准确度（方法学比对）7.体外诊断试剂分析性能评估指导原则精密度8.体外诊断试剂分析性能评估指导原则干扰实验9.体外诊断试剂分析性能评估指导原则稳定性10.体外诊断试剂分析性能评估指导原则参考值（参考区间）3附件 1：体外诊断试剂分析性能评估指导原则 编制说明体外诊断试
2、剂注册管理办法（试行） 颁布后，体外诊断试剂产品的注册过程中要求提供申报产品的分析性能评估资料，产品性能评估是产品研发、制定产品标准等过程的重要技术支持研究过程，并可能对产品的质量造成一定的影响。目前国际上对体外诊断试剂的性能评估通常是以美国临床实验室标准化组织（Clinical and Laboratory Standards Institude 以下称为 CLSI）的相关标准为依据，也是美国 FDA推荐采用的评价标准，但我国还没有相关的标准及指导原则的要求。为进一步明确体外诊断试剂分析性能评估的技术要求，我中心组织有关专家起草产品分析性能评估指导原则，以明确体外诊断试剂产品性能评估的技术要
3、求。体外诊断试剂产品性能评估包括检测限、线性范围、可报告范围、准确度（回收实验） 、准确度（方法学比较） 、精密度、干扰实验、稳定性、参考区间共九个项目。起草的主要依据 CLSI发布的以下标准:1. C28-A2: How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory; Approved Guideline-Second Edition. 42. EP5-A: Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices; App
4、roved Guideline.3. EP6-A: Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures; A Statistical Approach; Approved Guideline.4. EP7-A: Interference testing in clinical chemistry; Approved Guideline.5. EP9-A2: Method comparison and bias estimation using patient samples; Approved Guideline
5、-Second Edition.每项性能的主要研究方法均采用以上标准和国内实际采用的评价方法相结合的方法。我中心对于专家起草的指导原则的初稿进行了适当的文字调整，之后将分析性能评估指导原则发给十位相关专业的专家征求意见。意见返回后我们对专家的回复意见进行了整理，对有些意见进行了采纳，有些意见暂时没有采纳。采纳的意见，如：线性范围中的“3.4 计算公式”的描述采用专家意见将公式的书写进行了文字更改，与 CLSI 文件一致；“3.3 剔除离群值”中的 Y 的均描述由 Yave 改为 ；还有一些文字性错误也进行了修改。有一些专家意见因为对一些概念还存在分歧，因此暂时未采纳，待经过专家讨论会后再进行确
6、定。如“检测限评估”中5的检测方法“连续测定 20 次，计算均值加 2SD 的方法缺少依据，建议采用可报告范围评估下限所提供的方法。 ”；“建议将批内/批间精密度”改为“分析内/分析间精密度” ；“精密度是用变异系数表示还是用置信区间表示” ；参考值：“结果分析中应首先验证是否为正态分布，对于正态分布，则应根据临床应用目采用均值2SD 或均值 3SD，对于偏态分布则应选择单侧 95分位数或双侧 2.5-97.5分位数” 。由于一些概念在学术界还存在分歧，因此我们会通过上网征求意见和专家会的形式进行讨论，找到最理想、最适合企业及我国国情又能保证产品质量的评价方法。6附件 2体外诊断试剂分析性能评
7、估指导原则检测限（征求意见稿）一、概述检测限（limit of detection）是指检测方法可检测出的最低被测量浓度，也称检测低限（lower limit of detection）或最小检出浓度（minimum detectable concentration） ，有时也称为分析灵敏度（analytical sensitivity） 。检测限评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一。本指南基于国家食品药品监督管理局体外诊断试剂注册管理办法（试行） （以下简称办法 ）的有关要求，参考 CLSI 有关标准，对定量检测方法检测限的评估方法和数据处理方法进行了
8、要求。其目的是为生产企业进行定量检测方法检测限评估提供原则性指导，也为注册管理部门审核该部分分析性能评估资料提供技术参考。同时，本指南亦可指导临床实验室进行定量检测方法检测限评估。由于体外诊断试剂产品发展速度快、专业跨度大，国家食品药品监督管理局将根据体外诊断试剂发展的需要，适时对本指南进行修订。7二、 检测限评估的基本原则1. 实验人员应熟悉检测方法与仪器操作；2. 采用合适的校准品、质控品并保持仪器处于正常状态；3. 用于实验的试剂应为同一批号，且在有效期内。三、 检测限的评估和数据处理方法1. 实验材料和基本要求空白样本的制备：空白样本应不含被测物，但其基质应与待测定常规样本相同。如空白
9、样本难以得到，可采用 5%牛血清或人血清白蛋白溶液。或根据测定项目选用相应基质的样本，但应注意将基质效应减至最小。2. 实验方法在一次运行中将空白样本重复测定 20 次。3. 数据处理（1） 数据记录：将测定结果记录于表格中。如果检测系统对于低于零的结果报告为零，应记录初始响应值，如吸光度值等。（2） 数据统计：计算 20 次结果的均值 与标准差 SD。4. 结果报告：8以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限。 （ +2SD）附件 3体外诊断试剂分析性能评估指导原则线性范围（征求意见稿）一、概述线性范围评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一。本指南基于国家
10、食品药品监督管理局体外诊断试剂注册管理办法（试行） 、 中华人民共和国卫生行业标准-定量测定方法的线性评价的有关要求，参考 CLSI 有关标准，对定量检测方法中线性范围的评估方法和数据处理方法进行了原则性要求。其目的是为生产企业进行线性范围评估及准备线性范围评估资料提供原则性指导，也为注册管理部门审核该部分分析性能评估资料提供技术参考。同时，本指南亦可指导临床实验室建立定量测定方法的线性范围或对标称的线性参数进行验证。由于体外诊断试剂产品发展速度快、专业跨度大，国家食品药品监督管理局将根据体外诊断试剂发展的需要，适时对本指南进行修订。9二、线性范围评估的基本原则（1）实验操作人员应熟悉方法原理
11、与操作，能对样本进行正确处理，确保仪器工作状态正常，采用适当的校准品对仪器进行校准。（2）仪器的各项性能指标（如精密度）应与标称值相符，不存在明显的携带污染等。（3）应使用同批号试剂及校准品。三、线性范围的评估及数据处理方法1.实验样本的基本要求和制备方法1.1 基本要求（1）样本基质应与临床实验样本相似，但不可采用含有对测定方法具有明确干扰作用物质的样本，如溶血、脂血、黄疸或含有某些特定药物的样本。进行血清学标志物检测时，理想的样本为分析物浓度接近预期测定上限的混合人血清。（2）建立一种定量测定方法的线性范围时，需在预期测定范围内选择 7-11 个浓度水平。如将预期测定范围加宽至 130%，
12、在此范10围内选择更多的浓度水平，然后依据实验结果逐渐减少数据点直至表现出线性关系，可发现最宽的线性范围。（3）当对标称线性参数进行验证时，需在已知线性范围内选择5-7 个浓度水平。（4）无论是建立或验证线性范围，所选用的浓度水平应可覆盖整个预期测定范围并包括与临床有关的重要评价浓度，如最小测定浓度或线性范围的最低限、不同的医学决定水平、最大测定浓度或线性范围的高限等。1.2 制备方法（1）不同浓度水平的样本可通过将高浓度样本与低浓度样本进行倍比稀释得到，注意在进行液体吸取时应选择精密度与准确性好的移液装置。制备时应将样本完全混合并避免蒸发或其他使样本变质的情况。每份样本的浓度与体积单位应统一
13、。（2）如果高/低浓度血清的值未知，可将每种血清编码，用编码代表每个血清的相对浓度。对于等浓度间隔样本，可用连续整数（如 1、2、3、4、5）代表连续样本。进行数据处理时可用样本号代替 X 值。表 1 和表 2 中描述的样本制备过程是按照等浓度间隔的设计进行的，每个浓度水平的样本量为 1.00ml。制备非等浓度间隔的样本时应明确各样本间的浓度关系，测定时可以这些样本间的相对浓度比值做为 X 值。11表 1：11 个浓度水平的样本制备样本号 1 2 3 4 5 6低浓度血清(ml) 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50高浓度血清(ml) 0.00 0.10 0.20 0.3
14、0 0.40 0.50样本号 7 8 9 10 11低浓度血清(ml) 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00高浓度血清(ml) 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00表 2：5 个浓度水平的样本制备12样本号 1 2 3 4 5低浓度血清(ml) 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00高浓度血清(ml) 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00（3）样本的特殊处理：在无法得到适用的人血清时，需对样本进行一些特殊处理以满足实验要求。这些处理过程包括稀释、加入添加物或透析、热处理等，无论进行何种处理均应以保持基质恒定为基本原则。在评价报告中应对所使用的稀释液
15、、添加物、溶剂等的材料来源加以注明。样本稀释液应选用由厂家推荐或经实验室证明可使用的产品，如可采用 5%牛血清白蛋白或人白蛋白溶液。欲提高样本浓度时可在样本中添加分析物纯品。在添加物为溶液状态时，应注意添加液体对样本的稀释作用（小于 10%）并注明所用溶剂。2实验过程2.1 建立线性范围：需测定 9-11 个浓度水平，每个浓度水平重复测定 3-4 次。2.2 验证标称线性参数：需测定 4-6 个浓度水平，每个浓度水平重复测定 3-4 次。132.3 所有样本应在一次运行中或几次间隔很短的运行中随机测定，最好在一天之内完成。3.数据处理3.1 数据记录（1）可参考表 3 进行数据记录。（2）可采
16、用其它形式进行记录，但应注意保留原始数据。表 3：线性评价数据记录表（11 个浓度水平，重复测定 4 次）项目： 样品：仪器： 试剂/批号： 校准品/批号：操作者： 审核者： 测定日期：样本号 测定 1 测定 2 测定 3 测定 4 均值1234514678910113.2 数据可用性检查可通过绘制散点图对测定数据的可用性进行初步检查。以样本号或样本浓度为 X 轴，以测定结果为 Y 轴做图，在图上标出针对每个样本的测定值及每个浓度水平的测定均值，手工或用计算机做图将均值点相连，观察数据点与直线间的偏差，如偏差过大，表明数据组存在明显非线性，需要对测定过程进行检查，排除因操作错误所至误差，并对样
17、本进行重新测定。如图形与直线接近，表明可对数据组继续进行统计分析。3.3 剔除离群值离群值可由散点图初步判断，标准中建议采用格拉布斯（GRUBBS）法进行离群值检验。检验步骤如下:每组数据中有 4 个测定结果，分别记为 y1，y2，y3，y4。(1)将 4 个测定值按大小顺序排列,最大值记为 max,最小值记为 min;15(2)由 4 个测定值计算均值 和标准差 S:=(y1+y2+y3+y4)/4； (3)根据可疑值 max 或 min 分别按下式计算统计量 t:t1 = (max- )/S，t2 = (min- )/S;(4)根据给定的显著性水平 a 和重复测定次数查表得临界值;(5)如
18、 t 值大于临界值，则相应的可疑值为离群值。Grubbs 检验临界值(Ta)值表样本数显著性水平样本数显著性水平0.05 0.025 0.01 0.005 0.05 0.025 0.01 0.0053 1.153 1.155 1.155 1.155 4 1.463 1.481 1.492 1.4963.4 进行多项回归分析对数据组进行多项回归分析，得到一级、二级与三级多项式。一级多项式为直线，二级多项式表示上升曲线或下降曲线，三级多项式表示 S 形曲线（在测量范围两端具有明显的非线性） 。16多项式方程如下：级数 多项式 回归自由度（Rdf）一级 Y = b0 + b1X 2二级 Y = b0
19、 + b1X + b2X 2 3三级 Y = b0 + b1X + b2X 2 + b3X3 43.5 对回归方程进行线性检验多元回归方程中以 bi 表示的系数为回归系数。在二级与三级方程中，b2 与 b3 为非线性系数。对回归方程进行线性检验就是对每个非线性系数作 t 检验，判断回归系数与零是否有显著性差异。b0与 b1 不反映非线性，故不需对其进行检验。对 b2 与 b3 的检验方法如下：计算统计量 t，计算公式为：t = bi/ SEi其中，SE i 为每个非线性系数的斜率标准误，计算公式为：S其中，Y 为回归方程预测值， 与 为测定均值。17由公式 df = L*R-Rdf 计算自由度
20、，L 为样本数，R 为每个样本的测定次数，Rdf 为回归自由度，即回归方程中系数（包括 b0）的个数。如测定 5 样本，每个样本重复测定 4 次，则对测定数据进行回归分析后其三级多项式中 L=5，R=4，Rdf=4，df=5*4-4=16。在 t值表中寻找 t 界值（双边检验，=0.05） ，将计算出的 t 值与界值比较，如 p0.05，表示非线性系数与零无显著性差异，数据组被认为具线性，此时可对数据组进行精密度检验，具体方法见后。当精密度符合线性判断要求时，数据分析可结束。如 p9 P P P P P P L*R:样本数*重复测量的次数表 B 不精密度和 ADL 的临界值（ PctBnd=5
21、%， d=3 阶）/ %cL*R=10 L*R=12 L*R=14 L*R=16 L*R=18 L*R=201 5.5 5.5 5.4 5.4 5.4 5.42 6.1 6.0 5.9 5.9 5.8 5.83 6.7 6.5 6.4 6.3 6.2 6.24 7.2 7.0 6.9 6.8 6.7 6.65 7.8 7.6 7.4 7.2 7.1 7.06 8.4 8.1 7.9 7.7 7.5 7.47 9.0(P) 8.7(P) 8.4 8.2 8.0 7.88 P P 8.9(P) 8.6(P) 8.4 8.2239 P P P P 8.9(P) 8.7(P)9 P P P P P P
22、 L*R:样本数*重复测量的次数表 C 不精密度界值的常数最优拟合方程的阶数 精密度界值的常数（C）一阶或二阶 6.3三阶 6.524附件 4体外诊断试剂分析性能评估指导原则可报告范围（征求意见稿）一、概述定量分析方法的可报告范围（reportable range）是临床实验室发出检验报告的依据之一，可报告范围包括可报告低限与可报告高限。可报告范围评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一。本指南基于国家食品药品监督管理局体外诊断试剂注册管理办法（试行） 的有关要求，参考 CLSI 有关标准，对定量检测方法中可报告范围的评估方法和数据处理方法进行了原则性要求。
23、其目25的是为生产企业进行可报告范围评估及准备可报告范围评估资料提供原则性指导，也为注册管理部门审核该部分分析性能评估资料提供技术参考。同时，本指南亦可指导临床实验室对定量分析方法的可报告范围进行验证。由于体外诊断试剂产品发展速度快、专业跨度大，国家食品药品监督管理局将根据体外诊断试剂发展的需要，适时对本指南进行修订。 二、可报告范围评估的基本原则1.实验人员应熟悉测定方法与仪器操作。2.采用合适的校准品、质控品并保持仪器处于正常状态。3.用于评价实验的试剂应为同一批号，并在有效期内。三、可报告范围的评估及数据处理方法1.实验样本的基本要求和制备方法1.1 样本要求最好选择与测定样本具有相同基
24、质的样本。1.2 制备方法（1）低值样本：将待测样本（含被分析物）用混合人血清（含26被分析物浓度水平较低）或 5%牛血清白蛋白生理盐水溶液进行稀释，产生接近于方法线性范围低限浓度水平的样本，一般为 5 个浓度水平，浓度水平间隔应小于线性范围低限的 10%。（2）高值样本：选取含被测物的高值样本，必要时可添加被分析物的纯品，并计算出理论值。使用混合血清或 5%牛血清白蛋白生理盐水溶液或测定方法要求的稀释液对高值待测样本进行稀释，使其接近于线性范围的上 1/3 区域内，并记录稀释倍数。至少选用三个高浓度样本，稀释倍数应为方法性能标明的最大稀释倍数、并适当增加或减小稀释比例。2.实验过程在一次运行
25、中将低值样本重复测定 10 次，高值稀释样本重复测定 3 次。3.数据处理3.1 数据记录：可根据附表进行数据记录。3.2 数据统计：分别计算 AVE( )、SD、CV 值。对于可报告范围高限还应计算乘以稀释倍数后的还原浓度和相对偏差。4.结果报告4.1 可报告范围低限：以方法性能标示的 CV 值为可接受界值，由数据中选取 CV 值等于或小于可接受界值的最低浓度水平做为可报告范围低限。4.2 可报告范围高限：选取还原浓度与理论浓度的偏差（%）等于或小于方法标示 CV 值时的最大稀释倍数为方法推荐的最大稀释倍27数，方法线性范围的上限与最大稀释倍数的乘积为该方法可报告范围的高限。28附表：可报告
26、范围（低限）数据记录表浓度 1 浓度 2 浓度 3 浓度 4 浓度 512345678910AVESDCV%可报告范围（高限）数据记录浓度 1 浓度 2 浓度 3123AVE稀释倍数还原浓度理论浓度相对偏差（%）29附件 5体外诊断试剂分析性能评估指导原则准确度（回收实验） （征求意见稿）一、概述准确度评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一。定量检测方法的回收实验是评估准确度的方法之一，用于评估定量检测方法准确测定加入纯分析物的能力，结果用回收率表示。本指南基于国家食品药品监督管理局体外诊断试剂注册管理办法（试行） 的有关要求，参考 CLSI 有关标准，对
27、采用回收实验进行准确度评估的实验方法和数据处理方法进行了原则性要求。其目的是为生产企业采用回收实验方法进行准确度评估并准备准确度评估资料提供原则性指导，也为注册管理部门审核该部分分析性能评估资料提供技术参考。同时，本指南亦可指导临床实验室采用回收实验方法对准确度进行评估。由于体外诊断试剂产品发展速度快、专业跨度大，国家食品药品监督管理局将根据体外诊断试剂发展的需要，适时对本指南进行修订。二、回收实验评估的基本原则1.实验人员应熟悉测定方法与仪器操作。2.采用合适的校准品、质控品并保持仪器处于正常状态。30三、回收实验的评估及数据处理方法1.实验样本的基本要求和制备方法1.1 选择合适浓度的常规
28、检测样本，分为体积相同的 3-4 份。1.2 在其中 2-3 份样本中加入不同量的待测物标准，制成 2-3 个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。1.3 在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶剂，制成基础样本。2.实验过程用待评价方法对回收样本和基础样本进行测定，通常对样本进行2-3 次重复分析，取其均值进行计算。3.数据处理及结果报告3.1 计算回收率：回收率 1 = 3.2 计算平均回收率：平均回收率 =3.3 计算比例系统误差：比例系统误差 = 100% - 平均回收率3.4 可接受判断：比例系统误差不大于 CLIA 88 允许总误差的1/2。4 注意事项：4.1 加入体积：加入的标准液体积一般在样本体积的 10%以内；并且保证在加样过程中的取样准确度。
