1、miRNA 在肝细胞癌中的研究进展戚 鹏 高春芳（第二军医大学东方肝胆外科医院实验诊断科 上海 200438）摘要 微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控 RNA，通过序列特异性翻译抑制或 mRNA 裂解来调控基因表达，参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程。近期的研究发现，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。已发现若干 miRNA 直接参与肝细胞癌的发生和发展，miRNA 表达谱与肝细胞癌的诊断、分期、进展和预后等相关。作为一类新的分子靶标，miRNA 应用于肝细胞癌的诊断和生物治疗具有广阔
2、的前景。肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤，其死亡率位居第二。肝细胞癌的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程。寻找肝细胞癌发生、发展的相关基因，了解肝细胞癌的分子遗传学机制从而为肝细胞癌的诊断、治疗提供理论基础为目前的研究热点。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一些 5端带磷酸基团、3端带羟基的，长度为二十几个核苷酸的非编码调控 RNA 家族1。迄今在人类、动植物等物种中已有六千余种 miRNAs 被发现，通过调控基因表达来参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期发育、细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡（MiRBasehttp：mic
3、rornasangeracuksequences）。许多病毒也会与宿主的 miRNAs 相互作用，并且相当一部分病毒还能编码自己的miRNAs，调控自身蛋白的表达或者钝化宿主本身的防御系统2。最近多项研究发现，若干 miRNAs 在各种肿瘤组织中的表达水平有不同程度上调或下调，这一现象初步揭示了肿瘤发生与 miRNA 表达之间存在相关性。该领域的研究虽刚刚起步，新的发现与观点却层出不穷，miRNA 与肿瘤的关系已成为当前众多科学家关注的热点之一。本文就 miRNA 与肝细胞癌的相关性作一综述。1 miRNA 来源和作用机制与 siRNA 加工合成类似，miRNA 也是由一系列 RNaseIII
4、 内切酶和转运蛋白等逐步加工完成3。在细胞核内，首先由 RNA 聚合酶 II 或聚合酶 III 转录合成初级 miRNA（pri?miRNA），经过 Drosha 及 DGCR8 剪切形成 miRNA 前体（pre?miRNA），然后在输出蛋白 5（Exportin?5）和 Ran 复合物协助下转运出细胞核，随后在细胞质内，被 DicerTRBP 剪切成 2125 个核苷酸长度的双链RNA。通常，上述双链 RNA 中的一条单链会与 RNA 诱导的沉默复合体（RNA?inducedsilencingcomplex，RISC）结合，另一条链发生降解；也有一些miRNA 双链会打开并分别与不同的 R
5、ISC 结合。miRNA5端第 28 核苷酸与mRNA3端非翻译区（untranslatedregion，UTR）部分序列的结合很重要，被称为种子序列（seedsequence）。miRNA 参与的基因调控主要有两种方式，即靶 mRNA 的降解和翻译抑制。当 miRNA 和靶 mRNA 接近完全互补时多采取第一种方式，在植物中多见。而在动物中，多数情况下 miRNA 和靶 mRNA3?UTR 不完全互补配对，通过翻译抑制靶 mRNA 的表达。此外，也可以具有以上两种作用模式，即当与靶基因完全互补结合时，直接切割 mRNA，如果蝇和 HeLa 细胞中 let?7直接介导 RISC 分裂切割靶 m
6、RNA；而当与靶基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的 let?7 与靶 mRNA3?UTR 不完全配对结合后，抑制基因的翻译4。最近 Wu 等5又提出另外一种去腺苷酸化机制也参与了miRNA 的基因调控，已知 lin?28mRNA 的 3?UTR 与 miR?125b 不完全互补，他们把 miR?125b 转入人类胚胎肾细胞 293T 后，观察到连接了 lin?28 的 ?球蛋白 mRNA 明显缩短，这种缩短又与 3腺苷酸尾的清除有关。一个 miRNA 可调节数百个靶基因包括转录因子、细胞因子、受体等，几种 miRNAs 也可以联合调控单一基因的表达，miRNAs 和靶基因组
7、成了复杂的调节网络6。揭示 miRNA的作用机制对于我们认识体内 miRNAs 之间、miRNAs 与 mRNA 之间、miRNAs 与蛋白质以及与 DNA 之间的网络交互作用具有重要的意义。2 miRNA 与肿瘤的关系从细胞生物学角度来看，动物生长发育过程是与其细胞增殖、分化和死亡相互联系的，而细胞增殖、分化和凋亡等生物学进程的异常在肿瘤中常见。miRNA在动物生长发育、细胞增殖、分化、凋亡及基因调控中的作用，引发了人们对miRNA 与肿瘤之间关系的思考。原癌 miRNA 组学（Oncomirs）这一崭新概念的提出，开辟了将 miRNA 应用于肿瘤细胞研究的新篇章7。如果 miRNA 在肿瘤
8、中表达上调，就属于有致癌基因作用的 miRNA，它通过负性抑制肿瘤抑癌基因和或控制细胞的分化或凋亡途径来促进肿瘤的发展；而在肿瘤生成中，有些 miRNA 的表达是下调的，则这些miRNA 起抑癌基因的作用。21 有致癌基因作用的 miRNA在 B 细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤及套细胞淋巴瘤中，miR-17?92 基因簇（包括miR?17?5p、miR?17?3p、miR-18a、miR-19a、miR?20a、miR?19b?1 和miR?92?1）似乎起着癌基因的作用8。研究进一步证实，miR?17?5p、miR?20a 的靶基因是转录因子 E2F1，原癌基因 c?Myc 一方面促进细胞周期的进
9、程，同时激活 miR?17?92 基因簇的表达，转录后抑制 E2F1 促细胞凋亡的作用，促使细胞逃离正常的凋亡途径，获得永生性。过表达 c?Myc 和miR?17?92 基因簇的肿瘤与仅有 c?Myc 过表达的肿瘤相比，具有更强的增殖能力和更低的细胞死亡率9。此外，在人类 B 细胞肿瘤中及胰腺癌中发现另一和 c?Myc 有协同作用的 miR?155BIC 的过表达1012，miR?155 直接参与了这些疾病的发生与发展。Volinia 等13用芯片分析了 6 种实体瘤（肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、胰管癌）的 miRNA 表达谱发现，miR?21 均显著过表达，提示其在肿瘤形成过程中起
10、广泛的致癌作用。进一步的研究表明，miR?21 通过直接下调抑癌基因 tropomyosin?1（TPM?1）而发挥作用。Jennifer 等通过对原代多形性恶性胶质瘤细胞、体外建立的 6 种恶性胶质瘤细胞系（A172，U87，U373，LN229，LN428，LN308）与正常的胎儿及成人脑组织以及体外培养的正常的神经胶质细胞的比较分析，发现在恶性胶质瘤中 miR?21 的表达水平也大大提升，且与 caspases 相关的细胞凋亡途径相关14。这些研究表明 miR?21 可能是通过抑制关键性的凋亡相关基因的表达而促进恶性肿瘤的形成。22 有抑癌基因作用的 miRNALife Technolo
11、gies 四款万元产品，1.00 元起拍首个肿瘤抑制基因 miRNA 是在慢性淋巴细胞白血病（chroniclymphocyteleukemia，CLL）患者的 B 细胞中被发现的。大约 40的CLL 患者中有染色体 13q14 的缺失，而 miR?15a 和 miR?16?1 基因正好位于该缺失位点 LEU2 内含子内，导致在约 68的 CLL 患者中这两个基因的表达缺失或下调15。bcl?2 是一个抗凋亡基因，参与多种肿瘤的发生，Cimmino 等16发现，正是 miR?15a 和 miR?16?1 的缺失导致 bcl?2 的过表达，使受损细胞不能凋亡，进而导致肿瘤的形成。研究还发现，2
12、个 CLL 病人的 miR?16?1 前体的下游 7 个碱基中有一个 C 突变为 T，导致 miR?16?1 表达水平下降，进一步证明其具有抑癌基因的作用。miRNAlet?7 家族是典型的有抑癌基因作用的分子。在肺癌、结肠癌等肿瘤的研究中发现，let?7 负调控原癌基因 Raslet?60 的表达17，18，但不影响RasmRNA 的水平，说明 let?7 是通过抑制 mRNA 的翻译发挥作用，但不影响其转录作用。最近研究发现了 let?7 的另一靶癌基因HMGA2，HMGA2 作为一种原癌基因在良性和恶性间充质肿瘤等多肿瘤的形成中发挥作用19，20。进一步研究显示，let?7 对 HMGA
13、2 的作用主要依赖其 3?UTR，由于染色体移位毁坏了 HMGA2 的 3?UTR 的结构，无法与 let?7 结合而失去 let?7 的抑制作用，产生肿瘤转化的特征性改变。我们可以设想，有抑癌基因作用的 miRNA 转录、转运、加工以及随后的与靶癌基因作用的任一环节的缺失，都可能扰乱基因的正常调控而导致肿瘤的发生。肿瘤被认为是一种复杂的基因病，几乎在所有肿瘤的发生或发展过程中都有癌基因的过表达和或抑癌基因的表达缺失。Calin 等21研究发现 50以上的 miRNA 基因定位于与肿瘤相关的区域或脆性区域，与人类多种癌症有关。miRNA 通过调控 mRNA 的转译或其稳定性来参与正常细胞稳定状
14、态的维持，因此miRNA 的异常表达则可能导致其相应靶基因的异常，但是将所有的 miRNA 分为致癌作用与抑癌作用的 miRNA 这两类也是不可能的，因为细胞还有严格进化的监督机制来维持正常细胞的稳定性，因此，可以认为不同的细胞类型中，同样的 miRNA 可能作为癌基因或抑癌基因，而且在某类型的细胞中任何一个 miRNA的靶基因一般不会只有一个，而每一个靶基因又可能和多个 miRNA 相互作用，组成了错综复杂的调控网络，在转录后对各种基因进行复杂的调控，参与肿瘤的发生发展。对 miRNA 进行深入研究，将有助于我们对生物体各种生理病理机制的理解，促进对癌症等人类顽疾发病机制的研究，并最终可能为
15、癌症的诊断和治疗提供新的思路和理论基础。3 miRNA 表达谱在肝细胞癌发生、发展及治疗中的研究进展近年不断涌现对 miRNA 进行高通量检测的相关技术，比如 miRNA 芯片22、磁珠流式细胞 miRNA 表达谱检测23、定量聚合酶链式反应（quantitativepolymerasechainreaction，qPCR）24等，通过癌组织及癌旁正常组织的横向比较找出癌组织中特异表达的 miRNAs，并对各期进行纵向比较，找出肿瘤各期差异的 miRNAs，从而完成对肿瘤的诊断和分期。miRNA 的微阵列表达谱是一种快速、高通量的检测手段，大规模分析单个样本的表达谱的研究可以在条件均一的情况下
16、同时完成；同时在微阵列设计时可以将 miRNA 的前体和成熟的 miRNA 设计在一张微阵列上同时检测，与 Northern 等检测方法相比需要的总 RNA 量相对更少，在肿瘤发生过程中进行 miRNA 表达谱的鉴定有利于发现基因治疗的新靶点，并提高疾病诊断的正确性，某些特定的 miRNA 甚至被证明可以用于精确地预测病人的预后，可能为临床上确定一个治疗方案提供一个强有力的工具。31 miRNA 与肝细胞癌的发生肝细胞癌的发生与多个癌基因与抑癌基因及其产物的表达及结构异常有关，如上文所述，miRNA 既可以起到致癌基因的作用，又参与抑癌基因相关的肿瘤发生途径，其在肝细胞癌发生中的作用补充、丰富
17、了肿瘤的发生机制。Murakami 等25首次对包括慢性乙肝、丙肝、肝硬化及肝细胞癌等肝脏性疾病患者肝组织 miRNA 表达谱进行了系统地比较性分析。研究发现慢性乙肝、丙肝患者 miRNA 表达谱无显著性差异；慢性肝炎患者的miR?182，pre?miR?199b，miR?224 和 miR?15b 较肝硬化患者表达水平上调，而miR?28，miR?342，miR?126，miR?199a，miR?145b，miR?143，miR?368 和pre?miR?372 表达水平下调；肝癌组织中 miR?18，pre?miR?18 和 miR?22 较正常组织有更高水平的表达，miR?199a ，m
18、iR?195，miR?199a，miR?200a 和miR?125a 表达水平降低。以这些差异表达的 miRNAs 来区分癌变组织与正常组织，精确度能够达到惊人的 97。功能学研究发现，结缔组织生长因子（CTGF）和核因子?B 受体活化因子配体（RANKL）是 miR?18 的靶基因，而低表达 miR?199a 会过度激活肝细胞由 G2 期向 M 期的转换，从而可能诱发肝细胞癌的发生。Wang 等26比较了 157 个 miRNAs 在 19 例肝细胞癌患者肝癌组织与正常肝组织的表达水平，发现 19 个上调 miRNAs 与 3 个下调 miRNAs 与肝细胞癌发生相关，但只有 4 种 miR
19、NAsmiR?199a，miR?200a，miR?125a 和 miR?224 的表达水平与 Murakami 等25的研究结果一致。功能学研究表明，肝癌组织中表达水平上调最显著的 miR?224 能够抑制凋亡抑制因子5（apoptosisinhibitor?5，API?5）的转录作用，miR?224 的过表达促进了凋亡细胞的死亡与增殖，最终在肝细胞癌的发生过程中起到了重要的作用。Kutay 等27给予 Fisher 小鼠喂食缺乏甲基的食物（FMD）36 周后，其肝脏出现癌前病变；喂食 54 周后，肝脏出现癌变。与正常肝组织相比，Fisher 小鼠肝癌组织中有 9 个 miRNAs 表达水平升
20、高，且 c?Myc 的表达亦升高；而 3 个miRNAs 的表达水平降低。进一步的分析表明，在小鼠肝癌移植模型、50人肝癌样本（1020）、人和小鼠肝癌细胞系中，miR?130，miR?23 表达水平升高，而 miR?122 的表达水平降低，提示这些 miRNAs 可能都参与调控肝细胞癌发生相关的某些基因的表达。Meng 等28比较了正常肝组织、肝癌组织及 5 种肝癌细胞的 miRNA 表达谱，结果显示 miRNA 表达差异很大，分别有数种 miRNAs 发生上调或下调。有趣的是，肝癌组织及肝癌细胞中上调的 miR?21 能导致 PTEN 蛋白表达量减少，提示 PTEN 基因是 miR?21
21、潜在的靶分子。PTEN 是肿瘤抑制基因，其编码的磷酸酯酶在正常情况下能够抑制磷脂酰肌醇?3 激酶（phosphoinositide3?kinase，PI?3K）信号转导通路，而该通路是多种肿瘤维持生存所必须的调控通路。可以推测，高浓度的 miR?21 抑制 PTEN 基因的翻译，这种抑制作用触发了细胞增殖、转移和浸润等恶性生物学行为，对于肝细胞癌的发生具有重要的作用Gramantieri 等29比较了肝硬化与肝癌组织 miRNA 表达谱的差异，发现有35 个差异表达的 miRNAs，随后基于这些 miRNAs 对肝硬化与肝细胞癌样本进行聚类分析，准确率能够达到 90左右，可能作为肝细胞癌的诊断
22、指标。此外，肝脏特异性的 miR?122a 的表达水平在 70的肝癌组织和所有的肝癌细胞系中是下降的。最为重要的是 miR?122a 可以负向调控细胞周期蛋白 G1 的表达量29，而另一种差异表达的 miR?221 的靶基因是周期素依赖性蛋白激酶抑制因子（cyclin?dependent kinaseinhibitor，CDKI）CDKN1Cp57 和CDKN1Bp27，Life Technologies 四款万元产品，1.00 元起拍通过负向调控这两个 CDKI 蛋白的表达，使得更多的细胞处于 S 期，从而促进肝癌细胞的恶性增殖30。基于肝硬化与肝癌组织 miRNA 表达谱的差异，Varnh
23、olt 等31进行了更为细致的研究。应用 qPCR 的方法检测了 52 例原发性肝肿瘤患者肝组织的 miRNA 表达谱，这些患者包括良性的肝小瘤患者及恶性的肝细胞癌患者，且都伴随 HCV 感染，研究发现肝癌组织中分别有 10 个和 19个 miRNAs 表达水平较正常肝组织上调和下调，miR?198 和 miR?145 表达水平在肝肿瘤中不仅下调 5 倍，并且在从肝硬化到良性肝小瘤、肝细胞癌的癌变过程中逐步下调，也可能会成为肝肿瘤的诊断性指标。Huang 等32应用含有人类全部成熟 miRNA 和 miRNA 前体序列的 miRNA 微阵列分析了 10 对配对的非病毒性肝炎的肝细胞癌患者的肝癌
24、组织及癌旁正常肝组织的 miRNA 表达谱，发现肝癌组织中有 15 个 miRNAs 表达水平较正常肝组织发生上调，而只有 1 个 miRNA 表达水平下调。此外，有 18 个 miRNAs 在肝癌组织中特异性表达，6 个 miRNAs 在癌旁正常肝组织中特异性表达。32 miRNA 与肝细胞癌的分化Murakami 等25除了通过肝癌组织及癌旁正常组织的横向比较找出上文所述的肝细胞癌发生相关的 miRNAs，还对肝细胞癌各期进行纵向比较，发现miR?222，miR?106a，miR?92，miR?17?5p，miR?20 和 miR?18 与肝癌组织分化程度相关。此外，miR?92，miR?
25、20，miR?18，pre?miR?18 的表达水平在低分化的肝癌组织中最高，其中的 miR?20，miR?18，pre?miR?18 的表达水平与肿瘤分化程度呈负相关，而在肝癌组织中表达水平下调的 miR?199a 与肿瘤分化程度呈正相关，提示这些 miRNAs 在肝细胞癌的发生、分化过程中都起着至关重要的作用。Ladeiro 等33首次用 miRNA 表达谱区分良性与恶性肝肿瘤。研究发现，HBV或 HCV 感染、酒精性、肝硬化的正常肝组织 miRNA 表达谱无显著性差异，但与正常肝组织相比，肝癌组织中 miR?10b 和 miR?222 表达水平上调，miR?122a 和miR?422b
26、表达水平下调；miR?224 在良性及恶性肝肿瘤中都显著性上调，miR?422b 和 miR?122a 都显著性下调。此外，肝癌组织中miR?21，miR?224，miR?106a 和 miR?203 较良性肝肿瘤例如肝腺瘤或者肝细胞局部结节性增生有更高水平的表达。有趣的是，某些 miRNA 的表达水平与肝癌发生相关的危险性因素有关，比如 miR?96 与 HBV 感染后肝细胞癌相关，miR?126 与酒精性肝细胞癌相关。目前，绝大多数的研究仅仅关注于 miRNA 调控 mRNA 的功能，而 miRNA 自身的表达与功能又受哪些因素调控的研究还很少涉及。该研究发现了另一个有趣的结果：在肝肿瘤中
27、表达水平下调的 miR?375 在肝细胞腺瘤中的表达水平与编码 ?连环蛋白的基因是否突变相关；另一种miRNA，miR?107，在肝细胞核因子（hepatocyte nuclearfactor1，HNF?1）基因突变的肝腺瘤中表达水平下调，表明 miRNA 自身的表达受到包括蛋白质等其他因素的调控，进一步将 miRNA 介导的基因调控现象复杂化。33 miRNA 与肝细胞癌的转移预后Budhu 等34检测了 241 例肝细胞癌病人的肝癌组织 miRNA 的表达谱，发现有 20 个 miRNAs 与肝细胞癌的转移显著相关，其中 miR?219?1，miR?207 和miR?338 的表达水平上调
28、最为显著，而 miR?34a，miR?30c?1 和 miR?148a 的表达水平下调最为显著。此外，80肝细胞癌转移相关的 miRNAs（1620）与肝细胞癌病人的复发及存活率相关，为在分子水平上对肝细胞癌转移的发生机制提供了新的见解，对于肝细胞癌诊断预后以及治疗都有重要的意义。Jiang 等35通过比较 HBV 或 HCV 感染、肝硬化肝细胞癌患者肝组织 miRNA表达谱的差异发现，与正常肝组织相比，有 50 个 miRNA 前体在肝炎病毒感染且伴有肝硬化的非肝细胞癌患者中表达水平升高，但分别只有 4 个和 2 个 miRNAs在肝硬化患者和肝炎病毒感染患者中表达水平上调，提示肝炎病毒感染
29、和肝硬化联合作用才会导致非肝细胞癌患者 miRNA 表达谱显著性改变。其中有 9 个miRNAs 在 HBV 患者中的表达水平高于 HCV 患者，与 Murakami 等25及Ladeiro 等33的结果不太一致，可能是由于样本量太少的缘故。研究还发现，与癌旁正常肝组织相比，有 16 个 miRNAs 在肝细胞癌患者中表达上调或下调，但只有 3 个 miRNAsmir?199a，mir?199a 和 mir?18 的差异表达水平与Murakami 等25的结果一致。此外，通过比较肝炎病毒感染、肝硬化及肝细胞癌患者的肝组织 miRNA 表达谱的差异，发现患者肝炎病毒感染和肝硬化后肝组织的 miR
30、NA 表达谱发生显著性变化，而肝硬化到肝细胞癌阶段，miRNA 表达谱变化不明显，提示肝硬化前期阶段对肝细胞癌的发生、发展起着至关重要的作用，这无疑丰富了肝细胞癌发生、发展的分子生物学机制。更为重要的是，通过比较肝癌组织与正常肝组织中差异表达的 miRNAs 发现，其中大部分miRNAs 的表达水平与病人的生存时间相关，这些 miRNAs 低表达患者存活时间明显少于 miRNAs 高表达患者，可能为临床上确定一个治疗方案提供一个强有力的工具。34 miRNA 与肝细胞癌的治疗由于 miRNA 通常在癌细胞中表达异常，具有重要的原癌基因或肿瘤抑制基因的功能，对它们的表达量进行调节可能对肿瘤的基因
31、治疗产生很大的影响。此类研究最初通过下调一个 miRNA 基因miR?21 来抑制肿瘤生长。miR?21 在包括肝细胞癌的许多不同类型的癌细胞中都有过表达13，28，且对肿瘤抑制基因TPM?113和 PTEN28有抑制作用。通过抑制异种肿瘤移植模型，研究人员瞬时转染 2?O?甲基化寡聚核苷酸到 MCF?7 细胞系，并将此作为 miR?21 的阴性对照，然后将它们注射到母裸鼠的乳腺垫中36。28 天后，研究人员发现转染了 anti?miR?21 的 MCF?7 细胞产生的肿瘤要比对照组小 50，并且这种抑制效应维持了将近两周左右。随后，不断有研究小组宣布他们已成功地研制出在体内抑制 miRNA
32、的方法。Krtzfeldt 等37将 2?O?甲基化寡聚核苷酸的5和 3端分别连有 2 个以及 4 个磷硫酰基团制成 antagomiR，与胆固醇偶联以降低肾清除率（renalclearance）并增加其对 miRNA 的吸收能力。结果发现，连续向小鼠体内注射 3 次高剂量（80mgkg）的 antagomiR 会导致除脑部以外所有被检组织中的内源性 miR?16 表达量下调。研究人员随后抑制了肝细胞中miR?122 的表达，并分析了肝细胞的基因表达谱，结果发现有数百个基因的表达量发生了上调，且这些基因大多数与胆固醇的生物合成相关。事实上，在用antagomiR 抑制了 miR?122 后，细
33、胞质膜上胆固醇的表达量下降了近 40。这一发现无疑进一步证实了 antagomiR 具有潜在的临床治疗效果虽然以 miRNA 的调节作用为基础而设计的药物作为肿瘤的靶向治疗可能性极大，但是若要实现，还存在不容忽视的障碍。（1）单纯模拟某些特定 miRNA 仍然存在一定弊端，因为每个内源性 miRNA 可调控上千个靶点，这样势必会引起某些副作用。人工合成基因特异性的 miRNA（miRNAmimics，拟 miRNA）38，会对靶基因有较好的抑制效果。拟 miRNA 是根据特定靶基因的 3?UTR 末端设计的一小段寡核苷酸链，大小也是 22nt 左右，其 5末端和 3末端分别有大约6 个核苷酸序
34、列与靶基因的 3?UTR 末端互补，模拟体内 miRNA 的作用方式，对目的基因进行封闭，具有较高特异性。Life Technologies 四款万元产品，1.00 元起拍（2）单纯对内源性 miRNA 进行基因打靶或拮抗其效果也不理想，因为敲除某个miRNA 会影响被该 miRNA 调节的多基因的表达。为避免这一缺陷，可采用基因特异性靶向技术，即 miRNA 屏障技术（miRNAmaskingantisenseoligodeoxynucleotides）38。（3）如何增强治疗因子的效果。肿瘤的发生、发展往往由多基因调控，而单个 miRNA 通常可与若干mRNA3?UTR 完全或不完全配对，
35、导致靶 mRNA 降解或转录后翻译阻遏。由此利用生物信息学的方法，针对多个肿瘤高表达的基因设计一个模拟 miRNA 介导RNAi，单个模拟 miRNA 介导 RNAi 沉默多个基因是可行而且有效的治疗方案。这种方法的优点是它可以是携带多种同一反义单元的同型体或者是携带多种靶向不同 miRNA 的反义单元的异型体。此外，有时多个内源性 miRNA 来自同一个转录本，如 miR?17?92 的 pri?miRNA 中含 7 个独立的 miRNAs，若模拟 miR?17?92的前体结构即可设计单个启动子来实现表达多个 siRNA 的功能。（4）有研究表明，用吉西他滨（Gemcitabine）一种核苷
36、抑制剂来治疗恶性胆管瘤会改变miRNA 的表达模式39。此外，抑制 miRNA，如 miR?21 在恶性胆管瘤中的过表达，会增加 Gemcitabine 的毒副作用。因此 miRNA 可能会使机体产生耐药性。（5）评价治疗因子的稳定性及如何作用于特定组织中调节靶 miRNA 达到治疗疾病的目的等都是需要解决的问题。miRNA 治疗从实验室到临床应用还有待进一步研究。4 问题与展望肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤，其死亡率位居第二。每年全球 53 万肝细胞癌患者中 82是由于病毒性肝炎所致，其中 HBV 感染的约 60，HCV 约 40。此外，黄曲霉素、化学致癌物等其他因素也会导致肝细胞癌的发生，其
37、发病机制尚未完全清楚。近年来研究人员在 miRNA 与肝细胞癌等肿瘤发生领域的研究取得了较大进展，完善和丰富了肿瘤发生、发展的分子生物学与遗传学机制，为肝细胞癌等肿瘤的基因诊断、治疗提供了新靶点。尽管 miRNA 在肝细胞癌等肿瘤学领域的研究取得了一些进展，但仍有许多问题需要科研工作者们思考、解决。（1）在以往 miRNA 与肿瘤关系的研究中，通常只是鉴定 miRNA 的表达丰度，而鉴定核苷酸序列是否突变也应该受到同样的重视。碱基突变即 miRNA 多态性就很可能改变 miRNA 的功能，从而诱发肿瘤。Yang 等40就在肝细胞癌相关miRNAs 的研究中发现有 3 种 miRNAs 有碱基突
38、变的现象，但该研究表明 miRNA多态性不是肝细胞癌发生的主要因素。检测肿瘤组织特定 miRNA 序列是否突变，不但有利于了解肿瘤发生发展的机理，而且还可应用于肿瘤的诊断和治疗。（2）目前，绝大多数的研究仅仅关注于 miRNA 调控 mRNA 的功能，而 miRNA 自身的表达与功能又受哪些因素调控，miRNA 是否可以通过正负反馈调控自身的表达，miRNA 是否可以调控其他 miRNA 等其他各种类型的非编码 RNA 从而间接调控某些基因的表达等方面的研究还很少涉及。（3）miRNA 表达谱芯片技术具有高通量等特点，近来被广泛应用于肿瘤中 miRNA 基因表达的研究，与 qPCR 法、Nor
39、thernblot 法等相比，它能使我们更好地理解肿瘤与正常组织之间、肿瘤发展的不同阶段 miRNAs 的差异性表达，更便于研究 miRNA 在肿瘤发生、发展机制中的功能。但 miRNA 表达谱芯片存在一个明显的缺陷，即它只能分析已知的miRNA，不能分析未知的 miRNA。（4）尽管越来越多的 miRNA 作为人类疾病的生物标志物、决定因素和治疗靶点被发现，但其靶蛋白或靶基因的寻找从而指导基因治疗仍是制约该领域发展的瓶颈之一。（5）如何发展具有更长体内半衰期和更高效能的改良拟 miRNA 分子和反义分子，开展基于 miRNA 的转基因和基因敲除体内实验为该类药物研发的安全性与有效性提供更多有
40、价值的信息。这些问题的解决都将有利于理解 miRNA 在生命过程中扮演的确切角色，从而推动miRNA 在肝细胞癌等肿瘤临床诊断与治疗领域中的广泛应用。（6）miRNA 在生物的进化选择过程中扮演基因表达调节分子的重要角色，而对应于人 23 万个基因中，只有很少部分的编码基因起着对其他基因的调控作用，因此 miRNA 表达情况提供的是更为丰富的基因调控信息，但基因表达谱芯片和 miRNA 表达谱芯片都是从整体上研究 mRNA 和 miRNA 表达水平的有力工具，所以把两者结合起来可以更好地了解 mRNA 和 miRNA 整体的表达情况，以及 miRNA 在特定的生命活动中对靶 mRNA 的调控作用。尽管 miRNA 应用于基因诊断、治疗的尝试才刚刚开始，但已经显现了巨大的应用潜力，相信如果临床医院和基础研究机构能够联合起来，随着对这种特殊分子的深入了解，加上中国拥有的丰富的生物样本资源，一些以 miRNA 为靶点的新药物会不断出现，基于 miRNA 的转录后基因沉默将会掀开癌症等疾病基因诊断、治疗的新篇章。
