1、,单个实验室化学检测方法的确认,National Association of Testing Authorities(NATA),概要,基本情况 单个实验室方法确认的接受 什么是确认方法？ 什么是方法确认？ 化学检测方法确认需要十个步骤,例如: 确认一个方法去检测动物组织中抗生素的残留,基本情况,NATA Technical Note 17 (new version) IUPAC Harmonized Guidelines for Single Lab. Validation LGC (UK) In-house Method Validation a Guide for Chemical L
2、aboratories,标准方法,Organisation for International Standardisation (ISO) American Society for Testing Materials (ASTM) Association of Official Agricultural Chemists (AOAC) Standards Australia British StandardsPublication of Standard Methods a specialist, core business of the organisations concerned,标准方
3、法,要通过很多实验室的合作研究来确认.过程慢 在方法需要与方法建立之间有很长的时间滞后性,方法验证Method Verification 没有方法确认这么严格 是否实验室运行都得要专门的标准方法?,单个实验室方法确认的承认,EU (Decision 2002/657/EU) Codex Committees Methods of Analysis and Sampling Residues of Veterinary Drugs in Foods Pesticide Residues National Regulators APVMA AQIS FSANZ NRS States & Terri
4、tories 贸易伙伴Trading Partners,什么是确认方法?,该方法被证明适用于该目的 使用该方法所测得结果可靠; 结果合理可用于作决定,什么是方法确认?,系统评价一个方法，提供客观证据证明该方法能够满足特定检测目标的需要。 证明该方法是符合NATA要求的。,方法确认,1,6,10,7,8,9,3,5,4,2,VALIDATED METHOD,6,10,7,8,9,3,5,4,2,1,步骤1: 方法的具本要求,为特定明确用途的特殊需求.需要对所发展的方法的检测对象有的具本要求。什么是方法的需要? 你要检测什么? 在什么样品基质中? 你需要检测到什么浓度水平? 对结果你需要有多大可靠
5、性? 多少浓度范围? 是否客户还有其它特殊需要?,例如：具本要求: 动物组织中抗生素残留检测,自由化合物 或 结合化合物?仅母体, 或母体加代谢物?特殊动物组织, 如. 猪的肾脏调整检测限, 所需的定量限（ LOQ）?在定量限（ LOQ）或 MRL值上的可接受的确证限?样品里的预期浓度?所需的检测周期?多个的还是单个样品?,步骤 1: 方法的具本要求,对这些具本要求的确认将根本定义方法的范围,步骤 1: 方法的具体要求,为了确认方法的具本要求,还有哪些方法的工作特性需要发展呢?以下九个步骤,VALIDATED METHOD,DEVELOP SPECS,6,10,7,8,9,3,5,4,2,步骤
6、 2: 方法选择性,在(与样品一起提取出的)干扰存在下检测结果的准确性目标: 没有重大干扰 方法内在的选择性变化 通过分析含有可能干扰的样品来检查,例如：方法选择性: 动物组织中抗生素的残留检测,进行系列在日常检测中可能碰到的样品基质试验用交叉反应法检查(如免疫测定法),VALIDATED METHOD,DEVELOP SPECS,6,10,7,8,9,5,4,3,步骤 3: 线性范围,对方法而言是用一个计算模型去定义仪器响应与浓度之间的关系通常线性模型由图表表示测定线性范围要求: 6点校准标样，每点重复测定两次 在可能浓度的0-150% 或 50-150%严格评价数据, 不要只依赖 r2 值
7、,R2 = 0.984,步骤 3: 线性范围,对方法而言是用一个计算模型去定义仪器响应与浓度之间的关系通常线性模型由图表表示测定线性范围: 6点校准标样，每点重复测定两次 在可能浓度的0-150% 或 50-150%严格评价数据, 不要只依赖 r2 值,还要考虑可能的基质效应,with matrix,without matrix,(additive effect),without matrix,with matrix,例如：线性范围: 动物组织中抗生素残留检测,所有方法应用的基本原则 检查所有目标化合物的线性 范围覆盖期望浓度的 0150% 清楚基质效应,VALIDATED METHOD,DE
8、VELOP SPECS,6,10,7,8,9,5,4,步骤 4: 灵敏度,响应变化与浓度变化的比例,例如：灵敏度: 抗生素在动物组织中的残留检测,可能每天变化 每天例行检查保证满意的灵敏度 操作时带入部分QC(质量控制)样品,VALIDATED METHOD,DEVELOP SPECS,6,10,7,8,9,5,步骤 5: 精确度与准确度,两部分内容;精确度; 随机误差准确度(真实度); 系统误差 (与真值的偏离),步骤 5: 精确度与准确度,精确度 重复测定间的预期符合水平精确度的不同测定方法; 可重复性 可重现性 实验室内部的重现性 (通常使用的最好反映)通过对独立准备的合适样品组分重复分
9、析来测定 可控参考物质CRM(Controlled Refernce Material ) 参考物质RM(Refernce Material) 有典型分析浓度的真实样品 添加回收 样品,步骤5:精确度与准确度,准确度 检测结果与真值的接近程度 (或者与公认的参考值的接近程度)通过含有已知浓度的样品的重复分析来测定; 鉴定过的参考物质CRM(Certified Refernce Material ) 参考物质RM(Refernce Material) 添加回收 样品或其它不常用方法;即通过与已知系统偏差的参考方法来比较,例如:准确度与精确度: 动物组织中抗生素残留检测,实验室内检测的重现性, 更
10、适合用含有已知残留的样品来进行 回收率通常是重要的指标 CRMs 或 RMs 很难得到 需要依赖添加回收样品 100% 的回收率并不能保证结果的真实性 对样品中含有已知残留物的添加回收很重要 可能的话通过PT? 确证回收率,VALIDATED METHOD,DEVELOP SPECS,10,7,8,9,ACCURACY,TRUENESS,6,步骤 6: 检测限与定量限（LOD & LOQ）,检测限能可靠检测到的最低浓度 通常用在一种样品基质中的倍信噪比表示定量限能检测到的有可接受不确定度的最低浓度 通常,定量限是检测限的倍 没必要对所有方法都要有确定的检测限与定量限,步骤 6: 检测限与定量限
11、(LOD & LOQ),检测限 标准溶液的信噪比(S/N)不是一个适当的计算检测限的方法通过重复分析经过所有测试步骤的样品所得数据统计而得,例：检测限与定量限: 动物组织中抗生素残留检测,非常重要典型的残留检测方法 对确切的目标有详细的要求 对每一个的检测对象有不同的检测限与定量限 报告的结果表述为“未检出”有重要意义NATA 要求对痕量有机物残留进行确证 检测限 = 能被有效检测到与确证的最低浓度,VALIDATED METHOD,DEVELOP SPECS,LOD&LOQ,10,8,9,ACCURACY,7,TRUENESS,步骤 7: 线性范围,方法的工作范围，该方法下对结果有一个可接受
12、的不确定度水平 定量限 线性校正范围的高限（即最下限） 定量限 用在方法确认中的最低浓度,例：线性范围: 动物组织中抗生素残留检测,定量限 能可靠定量的最低浓度,VALIDATED METHOD,DEVELOP SPECS,10,RANGE,9,LOD&LOQ,ACCURACY,8,TRUENESS,步骤 8: 方法适应性,方法中对微小变化的适应性 象 pH, 温度, 流速,试剂浓度, 提取时间等的微小变化的影响. 方法的发展与实验室内重现性的研究将提醒化学家可能的潜在影响 可能的影响可以通过一次或同时进行的仔细设计的试验来评估 介绍限制影响的控制方法,例：方法适应性: 动物组织中抗生素残留检
13、测,在方法发展中经常使用在方法发展和或确认中研究任何确定的影响 必要的话, 介绍在可接受的限度内减少影响的控制方法 方法偏差 方法修正 内标,VALIDATED METHOD,DEVELOP SPECS,10,RANGE,LOD&LOQ,ACCURACY,9,TRUENESS,步骤 9: 计算不确定度,与计算结果关联的一个参数，用于表示所得结果的离差情况ISO 17025 和 NATA要求 方法的不确定度知识对结果的比较以及判定结果的合法性或调整检测限都是必要的 好的确认结果会有一个合理的不确定度 不确定度的估算对于检测对象及其结果的使用应该是合理的,例:方法不确定度估算: 抗生素在动物组织中
14、的残留,估算定量限及其相关控制浓度结果的不确定度 对方法所检测的每一个化合物者估算其结果的不确度,VALIDATED METHOD,DEVELOP SPECS,MU,RANGE,LOD&LOQ,ACCURACY,10,TRUENESS,步骤 10: 溯源,检测结果必须要溯源到一定的标准,通常是通过完整的关系链溯源到国家或国际标准,所有的步骤都有相应的不确定度 没有计算不确定度无法溯源 方法确认对溯源而已是首要步骤以下是量值溯源图,Traceable Chemical Test Results,Physical Measurements,Chemical Measurements,例:溯源: 动
15、物组织中抗生素的残留,保证分析所用标准品都被检定过,含有一定的不确定度的纯度或浓度 通过与NATA认证的校准实验室的比对 定期校准天平,定容玻璃器皿，注射器 测试样品能完全代表所检样品并且符合规定的需要 方法完全被确认过，包括不确定度的估算,DEVELOP SPECS,MU,RANGE,LOD&LOQ,ACCURACY,TRUENESS,确认方法,总结,方法的确认是对一个方法的系统评价，提供证据证明该方法 能满足专门用途的特别需要 方法的确认需要好好计划，是基于对所用方法的专门需要的理解基础上的严格方法确认能充分保证结果是符合要求的 仔细的试验设计将会提供多方面的方法的典型特征 不是所有的方法都需要评价方法的所有参数,范围,本方法是用于检测牛肉、肝脏及肾脏中抗生素A及其代谢物x, y & z的残留 ，浓度范围在 0.01 至 5.0 mg/kg. 定量限的结果估算不确定度是 0.005 mg/kg (95% 置信限.).,
