1、基因工程单克隆抗体 N 端氨基酸序列的测定郭玮1， 张晶1， 张峰1， 沈卫群2， 赵方萄3， 徐燕英3， 王佑春1*( 1 中国食品药品检定研究院 ， 北京 100050; 2 北京大学生命科学院 ， 北京 100871;3 北京协和医科大学 基础医学研究所 ， 北京 100005)摘要 目的 : 建立了具有焦谷氨酸封闭 N 端的重组抗体 N 端氨基酸序列分析方法 。方法 : 利用高温稳定的焦谷氨酸肽酶 ，基因工程重组单抗样品在高温变性条件下 ， 去除其 N 端焦谷氨酸封闭 。经还原 SDS PAGE 和电印迹后 ， 进行 N 端氨基酸序列测定 ， 并与电印迹后在 PVDF 膜上去封闭处理效
2、果进行比较 。结果 : 测定了 17 种基因工程单克隆抗体 ， 其中有 7 个为重链去封闭处理后再进行测序的抗体样品 ， 用 2 种方法都可顺利去除 N 端封闭的焦谷氨酸 ， 从而进行 N 端氨基酸序列测定 ;如果不进行去封闭处理 ， 部分样品无法进行 N 端氨基酸序列测定 。结论 : 2 种方法都适于 N 端具有焦谷氨酸封闭单抗的氨基酸序列分析 。关键词 : 基因工程 ; 单克隆抗体 ; N 端氨基酸 ; 序列测定 ; 焦谷氨酸 ; 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ; 电印迹中图分类号 : R917 文献标识码 : A 文章编号 : 0254 1793( 2012) 06 1059 05Sequenci
3、ng of amino acids at N terminus of recombinant antibodyGUO Wei1， ZHANG Jing1， ZHANG Feng1， SHEN Wei qun2，ZHAO Fang tao3， XU Yan ying3， WANG You chun1*( 1 National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China2 Life Sciences， Peking University， Beijing 100871， China; 3 Beijing Institute
4、 of Basic Medicine Peking Union Medical College， Beijing 100005， China)Abstract Objective: To establish a analysis of recombinant antibodies N terminal amino acid sequence blockedby using N terminal pyroglutamate Methods: Using stability pyroglutamate peptidase in high temperature， re-combinant mono
5、clonal antibody samples denaturing under high temperature conditions， removing the N terminalpyroglutamate blocked By reduced SDS PAGE and electroblotting， the N terminal amino acid sequencing andcompared with the treatment effect of PVDF membrane after electric blotted Results: Determination of 17
6、genetical-ly engineered monoclonal antibodies， including seven for the heavy chain blocked after treatment of the sequencingantibody samples， using the both methods can successfully remove the N terminal pyroglutamate blocked to the N terminal amino acid; to sequence N terminal amino acid sequence i
7、f not to remove deblocking， part of the sam-ple can not existe N terminal amino acid sequencing Conclusion: The developed method was suitable for the N terminal amino acid sequencing of McAb with pyroglutamate blockageKey words: recombinant monoclonal antibody; pyroglutamate blockage; N terminal ami
8、no acid; sequencing; pyro-glutamic acid; SDS PAGE; electroblotting生物工程产品的质量控制是保障产品质量的关键 ， 其中 N 端氨基酸序列测定是分析蛋白质一级结构的一个重要环节 ， 可以考察信号肽切割是否整齐 、目的产物在培养液中以及分离纯化过程中是否有降解等 。抗体是由 B 淋巴细胞转化而来的浆细胞所分泌 ， 每个 B 淋巴细胞只能产生针对一种特异抗原决定簇的抗体 ， 即单克隆抗体 ， 简称单抗 。区别于杂交瘤技术产生的单抗 1， 基因工程抗体是利用抗体工程技术将抗体的基因按不同需要进行加工 、改造和重新装配 ， 然后导入适当的
9、受体细胞 ( 如哺乳动物细胞 、大肠杆菌 ) 中进行表达 ， 从而满足大规模培9501药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012， 32( 6)* 通讯作者 Tel: ( 010) 67095707; E mail: guowei nicpbp org cnDOI:10.16155/j.0254-1793.2012.06.037养 、大量生产的需要 。单抗是由 2 条重链和 2 条轻链组成 ， 链间有二硫键连接形成四肽结构 。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS PAGE) 分离出免疫球蛋白的重链和轻链 ， 再使用 PVDF 膜电印迹 ， 可以用于单抗的微量测序 。但如果单抗 N
10、端具有封闭的基团 ， 即使蛋白质已被成功地转印到 PVDF 膜上仍 无法直接利用 Ed-man 降解法进行测定 。本研究对去除 N 端焦谷氨酸封闭的方法进行了摸索 ， 并用 2 种方法分别去除了抗体的 N 端封闭 。去封闭后的样品经 SDS PAGE、电印迹后 ， 用氨基酸序列分析仪可顺利进行 N 端氨基酸序列测定 。1 材料与方法1. 1 材料17 种重组单克隆抗体 ， 本实验室保留样品 ， 由企业提供 。编号为抗体序号 1 17。试剂 A: 焦谷氨酸肽酶 ( Pfu glutamate Aminopep-tidase) 及 5 X 缓 冲 液 购 自 TaKaRa 公 司 ， codeNo
11、. 7334; 试剂 B: PVDF( P/N66543) PolyvinylideneFluoride Transfer Membrane 0. 45 m 购自 Pall 公司 ;试剂 C: 聚乙烯吡烙烷酮 EC No: 201 800 4( S: 2224/25) ( PVP 40) 购自 Sigma 公司 ; 试剂 D: 碘已酰胺 ( Iodoacemide) 购自 Sigma 公司 。氨基酸序列分析所用试剂均购自 ABI 公司蛋白测序产品目录 ( 美国 ) 。所有的化学试剂均为测序级 。仪器 A: 电泳仪 : Invitrogen。按说明书操作 。聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS PAG
12、E) : NuPAGE NovexBis Tris Mini Gels ( Invitrogen) 4% 12%， 1. 0mmX10wells invitrogen， Cat no NP0321， NuPAGEMES SDS Runing Buffer( 20X) NP0002; 仪器 B: 电转仪 : Bio Rad 公司产品 ， 10v， 60 min; 仪器 C: 美国ABI 公司 PROCISE 491 型蛋白质 N 末端氨基酸序列分析仪 ( ABI 公司 ， The Model 610 A”工作站 ) 。运行条件 : 按仪器的操作程序使用 。该实验分别由北京大学生命科学院和中国医学
13、科学院基础医学研究所共同协作完成 。1. 2 溶液配制 溶液 A( 焦谷氨酸肽酶溶液 ) : 将10 mU 焦谷氨酸肽酶溶解在 50 L1X 缓冲液溶中( 试剂 A 中的 5 X 缓冲液稀释 ) ; 溶液 B( 磷酸缓冲液 ) : 0. 1molL1磷酸缓冲液 ( pH8. 0) 含有 5mmolL1DTT， 10 mmolL1EDTA 和 10% ( v/v)乙腈 ; 溶液 C( 2 Tris Glycine SDS 样品缓冲液 ) :称取 Tris 0. 303 g、盐酸 0. 189 mL、甘油 4 mL、溴酚蓝 2 mg、SDS 0. 8 g， 巯基乙醇 2 mL 加超纯水溶解至 10
14、 mL。1. 3 电印迹 单抗样品在溶液 C 中 ， 100 水浴 3min， 冷却至室温后加入 200 mmolL1碘已酰胺 ，室温避光反应 20 min， 加入 1 molL1DTT， 通过SDS PAGE 分离出免疫球蛋白重链和轻链 。使用PVDF 膜在半干印迹的仪器上进行转印 。转印后 ，将膜放入 0. 1% ( w/v) Coomassie Brilliant Blue R 250 的染色液中 5 min， 在 40%( v/v) 甲醇 10%( v/v)冰醋酸水溶液中脱色 。1. 4 PVDF 膜上去封闭处理 切下 PVDF 膜上带有蛋白质免疫球蛋白重链区带的部分 ， 用少量乙腈浸
15、湿膜片 ， 将其浸泡于含有 100 mmolL1醋酸的0. 5%( w/v) 聚乙烯吡烙烷酮吡烙烷酮中 ， 在 37 保温 30 min 以封闭膜上未结合的蛋白质的位点 。再把膜浸泡于 0. 1 molL1磷酸缓冲液溶液 100L 中 ， 加入焦谷氨酸肽酶 5 g，( 酶 /底物 1 1 1/10) ， 37 保温 24 h， 用去离子水清洗膜片 ， 真空干燥 ， 2 8 保存 ， 备用 2 4。1. 5 溶液中的去封闭处理 取焦谷氨酸肽酶溶液25 L、5% Tween 20 溶液 2 L、待测样品 10 g，置于 1. 5 mL 离心管中 ， 1X buffer 补足体积至 100L， 混匀
16、 ， 10000 rmin1离心 30 s， 75 水浴 6 h;加入 5X 还原 buffer 25 L， 10000 rmin1离心 30s， 85 水浴 5 min; 10000 rmin1离心 30 s， 电泳和PVDF 转膜 ， 室温干燥之后 ， 2 8 保存备用 。2 结果2. 1 电泳以及转膜结果 抗体样品经还原 SDS PAGE 分离重链 、轻链的图谱及电印迹膜染色图谱见图 1。PVDF 膜上去封闭处理 : 电印迹后对 PVDF膜上的重链进行剪切 ， 再用焦谷氨酸肽酶去封闭处理 ( 图 1 A) ; 溶液中的去封闭处理 : 抗体样品经焦谷氨酸肽酶处理后进行还原 SDS PAGE
17、 分离重链 、轻链以及电印迹转膜 ( 图 1 B) 。2. 2 基因工程单克隆抗体轻链和重链 N 末端氨基酸序列分析分别对基因工程的人源化抗体 、人 鼠嵌合抗0601 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012， 32( 6)图 1 SDS PAGE 电印迹转膜图谱Fig 1 Map of SDS PAGE electroblotted transfer membraneA 条带 1 marker， 条带 3 5 抗体序号 15( 上样量约 24 g/条带 ) line1: invitrogen marker， line3 5 McAb No. 15( loading abou
18、t 24 g/line) B 条带 1 marker， 条带 2 5 抗体序号 15( 上样量约 3 g/条带 ) line1: marker， line2 5 McAb No. 15( loading about 24 g/line) 体等 17 个单抗进行测序 。这些抗体样品经还原SDS PAGE 分离出免疫球蛋白的重链和轻链 ， 经电印迹转膜染色后直接进行测序 。其中轻链 N 端测序结果全部符合理论序列 ; 9 种重链结果符合理论序列 ， 其余 8 个样品没有测出重链序列 ; 轻链和重链都符合理论序列的抗体有 9 个 ， 其中 8 种单抗 ， 分别为抗体序号 4， 6， 7， 8， 10
19、， 12， 14， 16， 17， 其共同特征为重链 N 末端的第 1 个序列基本上都为谷氨酸( E) ; 另 1 个单抗 ( 序号 7) ， 重链和轻链 N 末端的第 1 个序列为谷氨酰胺 ( Q) ; 不能直接测出序列的 8种单抗重链 N 末端的第 1 个序列都为谷氨酰胺( Q) 。结果见表 1。表 1 17 种基因工程单克隆抗体 N 末端氨基酸序列测定结果Tab1 sequencing of 17 amino acids at N terminus of McAbs序号( McAbNo )名称( name)理论序列 ( theory sequencings) 测序结果 ( results
20、 of sequencing)轻链 N 末端 ( 1 15) N terminus LC( 1 15) 重链 N 末端 ( 1 15)( N terminus HC( 1 15) LC HC1 chLym 1 DIQMTQSPASLSASV QVQLKESGPGLVAPS 一致 ( consistency) *2 抗 CD22 单抗 ( anti CD22 McAb) DIQLTQTTSSLSASL QVQLQESGGGLVKPG 一致 ( consistency) 3 Cetuximab DILLTQSPVILSVSP QVQLKQSGPGLVQPS 一致 ( consistency) 4
21、抗 CD11a 单抗 ( anti CD11a McAb) DIQMTQSPSSLSASV EVQLVESGGGLVQPS 一致 ( consistency) 一致 ( consistency)5 抗 CD25 人源化单抗 ( anti CD25 huMcAb) DIQMTQSPSTLSASV QVQLVQSGAEVKKPG 一致 ( consistency) 6 抗 CD25 人鼠嵌合单抗 ( anti CD25chimeric McAb) QIVLTQSPAIMSASP EVQLQQSGTVLARPG 一致 ( consistency) 一致 ( consistency)7 抗 CD20
22、单抗 ( anti CD20 McAb) QIVLSQSPAILSASP QVQLQQPGAELVKPG 一致 ( consistency) 一致 ( consistency)8 抗 HER 2 单抗 ( anti HER2 McAb) DIQMTQSPSSLSASV EVQLVESGGGLVQOG 一致 ( consistency) 一致 ( consistency)9 抗 CD52 单抗 ( anti CD52McAb) DIQMTQSPSSLSASV QVQLQESGPGLVRPS 一致 ( consistency) 10 Avastin DIQMTQSPSSLSASV EVQLVESG
23、GGLVQPG 一致 ( consistency) 一致 ( consistency)11 抗 EGFR 单抗 ( anti EGFR McAb) DIQLTQTTSSLSASL QVQLKQSGPGLVQPS 一致 ( consistency) 12 抗人血小板膜糖蛋白 IIb/IIIa 单抗 QIVLTQSPALMSASP EVQLQQSGPELVNPG 一致 ( consistency) 一致 ( consistency)13 抗 CD3 单抗 ( anti CD3McAb) DIQMTQSPSSLSASV QVQLVQSGGGVVQPG 一致 ( consistency) 14 抗 T
24、NF 单抗 ( anti TNF McAb) DILLTQSPAILSVSP EVKLEESGGGLVQPG 一致 ( consistency) 一致 ( consistency)15 h R3 DIQMTQSPSSLSASV QVQLQQSGAQVKKPG 一致 ( consistency) 16 抗 IgE 单抗 ( anti IgE McAb) DIQLTQSPSSLSASV EVQLVESGGGLVQPG 一致 ( consistency) 一致 ( consistency)17 Xolar DIQLTQSPSSLSASV EVQLVESGGGLVQPG 一致 ( consistenc
25、y) 一致 ( consistency)注 ( note) : “* ”: 被封闭的 ( blocked)采用 PVDF 膜上去封闭处理方法 选择重链 N 末端的第 1 个序列为谷氨酰胺 ( Q) 其中的 2 个单抗 : 抗体序号 2 和抗体序号 5 进行去封闭处理后测序 。结果表明 : N 末端第 1 个序列被焦谷氨酸肽酶消化 ， 序列从第 2 个开始测出并与理论序列相符 ，结果见表 2， 色谱图见图 2。在对抗体序号 2 和 McAb 序号 5 转膜去封闭后的重链 N 末端氨基酸序列测定结果的基础上 ， 再次采用 PVDF 膜上去封闭处理方法对另外的 5 种 N 端封闭的基因工程单抗进行了
26、去封闭处理 ， 并与溶液中的去封闭处理方法 ( “1. 5”项下 ) 进行了比较 ， 结果表明采用上述的 2 种方法都可以成功的去除重链 N 末端第 1 个氨基酸残基理论序列为谷氨表 2 抗体序号 2 和抗体序号 5 转膜去封闭后的重链N 末端氨基酸序列测定结果Tab 2 The sequencings McAb No2 and McAb No5at N terminus of McAb after deblocked抗体名称( name)重链 N 末端理论序列 ( 6 个 )( theory sequencings at N terminus)测序结果分析( result)anti CD22
27、 McAb QVQLQE VQLQEanti CD25 huMcAb QVQLVQ VQLVQ酰胺 ( Q) 封闭的抗体 。去封闭处理后的结果见图3， 图 3 中的 A、B、C、D 和 E 分别为抗体序号 13， 9，3， 15， 11。图 3A、B、C、D 和 E 中的 、为PVDF 膜上去封闭处理方法的测序色谱图 ， 图 3A、B、C、D 和 E 中的 、为溶液中去封闭处理方法的测序色谱图 。1601药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012， 32( 6)图 2 转膜去封闭后的 HPLC 色谱图Fig 2 HPLC profiles of transfer membran
28、e and deblockedA 抗体序号 2( profiles of McAb NO2) ， 氨基酸残基依次 ， 、为 VQL( amino acid sequence ， 、 are respectively VQL) B 抗体序号 5( profiles of McAb NO5) ， 氨基酸残基氨基酸残基依次 、为 VQL( amino acid sequence 、 are respectively VQL)图 3 去封闭后 HPLC 的色谱图Fig 3 HPLC profiles of deblockedA 抗体 13( McAb No13) B 抗体 9( McAb No9) C
29、 抗体 3( McAb No3) D 抗体 15( McAb No15) E 抗体 11( McAb No11)、和 为 PVDF 膜上去封闭 (， ， were deblocked on PVDF membrane) 、和 为溶液中去封闭 ( ， ， were deblocked in sotution)2601 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012， 32( 6)3 讨论本文进行测序的 17 个样品 ， 有 9 个样品 N 端的第一个序列为 Q， 其中 1 个抗体 ( 序号 1) 虽然也为 N 端谷氨酰胺封闭 ， 但没有对其进行去封闭处理 。1 个抗体 ( 序号 7)
30、 N 端的重链和轻链都为谷氨酰胺 ( Q) ， 但并没有经过去封闭处理 ， 可以转膜后直接进行测序 。也没有进行去封闭处理的研究 。其他 7 个样品的试验数据表明 ， 这些样品经还原 SDS PAGE 分离重链 、轻链及电印迹转膜染色后直接进行测序 ， 重链 N 端序列用 Edman 降解法无法测出 ( 数据见本文表 1) 。这些样品必须经过去封闭处理才能够测出重链 N 端序列 。N 端封闭的种类有很多 ， 从我们的结果来看 ， 基因工程单抗 N 端的封闭是比较常见的 ， 我们遇到的封闭种类都为谷氨酰胺环化为焦谷氨酸残基而被封闭 。如果采用原位PVDF 膜上去封闭的方法 ， 优点是可以对浓度较
31、高的抗体进行处理 ， 因此处理多个样品时不需要更多的加样孔就可以满足蛋白测序需要的蛋白量要求 。试验也可以过夜 、分段完成 。缺点则表现为需要首先对样品进行二硫键还原处理及烷基化步骤 ， 在对剪切膜片的处理中需要配制新鲜的酶切缓冲液 ， 该酶切液的配制需要较多的试剂 ， 操作步骤比较繁杂 。因此存在较多的不确定因素 。而本文用另一种溶液中高温条件下去封闭的方法相对来说则比较简单 ，特别是购买商品化试剂焦谷氨酸肽酶的同时也提供了酶切缓冲液 ， 经稀释后直接使用 ， 操作简单 。减少了试验中的不确定因素 ， 保证了结果的重复性 。缺点是需要试验当天完成 ， 所用时间较长 ， 又因为 1 次处理的样
32、品量少 ， 需要较多的上样孔 ， 转膜后需要合并条带 。因此一次最多处理 2 个样品 。文献报道 TaKaRa 公司的外切型氨肽酶 Pfu Py-roglutamateAminopeptidase 来源于高度耐热古细菌Pyrococcusfuriosus， 能够在 75 高温条件下有效发挥作用 ， 经焦谷氨酸氨肽酶的水解 ， N 端封闭的焦谷氨酸释放到溶液中 ， N 端序列从第 2 个氨基酸残基测出 。焦谷氨酸肽酶作用于相对较大蛋白 ， 有时不能有效的去除 N 端封闭的焦谷氨酸 ， 甚至有时结果在不同的试验室间不能重复 6。但本文的研究结果表明 ， 不论采用原位 PVDF 膜上去封闭的方法还是
33、溶液中高温条件下去封闭的方法 ， 对重链N 端具有焦谷氨酸封闭序列的重组抗体进行去封闭处理后 ， 都可以成功地去除焦谷氨酸形成的 N 端封闭 ， 得到了较好的效果 。4 小结本实验通过对 17 种不同单抗测序的研究中发现 ， 绝大多数单抗重链 N 端第一个残基为谷氨酰胺的重链在转膜后无法直接测出其序列 ， 只有经过去封闭处理后才可以测出 。目前 ， 国内一些药品研究 /制造企业基本上还没有建立重链 N 端封闭抗体序列测定的方法 。本文确定的去封闭方法解决了以上问题 ， 且简便 、快捷 、准确 ， 便于推广 ， 对 N 端被封闭抗体的氨基酸序列确认有重要意义 。参考文献1 PAN meng( 潘
34、萌 ) ， KONG yun( 孔蕴 ) ， CHEN chang( 陈畅 ) ， et alResearch progress of monoclonal antibody drugs( 单克隆抗体药物的研究进展 ) Chin J Biochem Pharm ( 中国生化药物杂志 ) ， 2008， 29( 9) : 622 Moyer M， Harper A， Payne G， et al In situ digestion with pyrogluta-mate aminopeptidase for N terminal sequencing electroblotted pro-tei
35、ns J Protein Chem， 1990， 9: 2823 Hisashi H， Sersuko K Deblocking and subsequent microsequence a-nalysis of Na blocked proteins electroblotted onto PVDF membraneJ Biochem， 1992， 111: 7544 Ruedi H， Aebersold， John L， et al Internal amino acid sequence anal-ysis of proteins separated by one or two dime
36、nsional gel electropho-resis after in situ protease digestion on nitrocellulose Proc Natl AcadSci， 1987， 84: 69705 WEI Jing shuang( 魏敬双 ) ， CHENG Li jun( 程立均 ) ， JIA Qian( 贾茜 ) Sequecing of amino acids at N terminus of recombinant an-tibody( 重组抗体的 N 端氨基酸序列测定 ) Chin J Biolog( 中国生物制品学杂志 ) ， 2008， 21( 12) : 11186 William EW The removal of pyroglutamic acid from monoclonal anti-bodies without denaturation of the protein chains Anal Biochem，2005， 342: 120( 本文于 2011 年 5 月 16 日收到 )3601药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012， 32( 6)
