1、ELISA 操作流程（一） 、基本操作流程 方法一 双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）1. 包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为 0.520gml，按 100ul/孔加入酶标板，4包被过夜。 2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔） ，漂洗 2-3 次，每次 3-5min；3. 封闭：按 200-250ul/孔加入封闭液，室温 2-3 小时或 371-2 小时，也可 4封闭过夜，然后弃去孔内封闭液； 4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度； 5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度
2、（定性分析可省略本步骤） ；6. 加样：按排列顺序依次加入 50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或 37孵育 30-60min； 7. 洗板：同步骤 2； 8. 加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按 50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或 37孵育 1 小时；9. 洗板：同步骤 2； 10. 加底物液显色：按 100-150ul/孔加入新配制的 TMB 底物溶液，室温避光反应15 30 分钟。11. 终止反应：于各反应孔中加入 50ul 的终止液。12. 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴
3、性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+” 、 “-”号表示。也可在酶标仪上于 450nm(若以 ABTS 显色，则 410nm)处测 OD 值。检测时以空白对照孔调零后测各孔 OD 值，若样品孔中的 OD 值大于阴性对照孔的 2.1 倍，即为阳性。 方法二 间接法（用于检测未知抗体） 1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至 0.520gml，按 100ul/孔加入酶标板，4 包被过夜，次日洗涤 2-3 次； 2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔） ，漂洗 2-3 次，每次 3-5min； 3. 封闭：按 200-250ul
4、/孔加入封闭液，室温 2-3 小时或 371-2 小时，也可 4封闭过夜，然后弃去孔内封闭液； 4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度； 5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤） ； 6. 加样：按排列顺序依次加入 50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品 (含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或 37孵育 30-60min； 7. 洗板：同步骤 2； 8. 加酶标抗体：按 50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体） ，室温或 37孵育1 小时；酶标抗体的稀释按产品说明书；9. 洗板：同步骤 2； 10. 加底
5、物液显色：按 100-150ul/孔加入新配制的 TMB 底物溶液，室温避光反应15 30 分钟。 11. 终止反应：于各反应孔中加入 50ul 的终止液。 12. 结果判定：裸眼观察结果或用酶标仪测 OD 值，有色产物的生成量抗体量。 (二) 、ELISA 常用的四种方法 1直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面；加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；加入底物； 结果判定：有色产物的生成量抗原量。 2间接法测定抗体将抗原吸附于固相载体表面；加待检抗体, 形成抗原- 抗体复合物；加酶标抗体（抗抗体） ；加入底物； 结果判定：有色产物的生成量抗体量。 3双抗体夹心法测定抗原将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体 ); 加入底物； 结果判定：有色产物的生成量抗原量。4. 竞争法测定抗原将抗体吸附在固相载体表面;加入酶标抗原和待测抗原；加入底物； 结果判定：对照孔与样品孔有色产物的生成量的差与未知抗原的量成负相关。
