1、细菌的革兰氏染色法实验目的： 1 学习并初步掌握革兰氏染色法。 2 了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。实验原理：革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Christain Gram 氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是 细菌学中最重要的 鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂 （如番红）复染。 经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏
2、阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处 理时，两 类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径 缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染 剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，
3、细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。实验器材： 1菌种 大 肠杆菌 (Escherichia coli) 约 24h 营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)约 24h 营养琼脂斜面培养物，蜡 样芽孢杆菌（Bacillus cereus）1220h营养琼脂斜面培养物。 2染色剂 革兰氏染色液。 3. 仪器或其它用具 显微镜，酒精灯， 载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水。实验内容：1制片 取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。 *要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱
4、色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 2初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色 1-2min，水洗。 3媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约 1min，水洗。 4脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片 倾斜，在白色背景下，用滴管流加 95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 *革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革 兰氏染色操作的关 键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约 20-30s。 5复染用番红染液复染约 2min，水洗。 6镜检 干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色是革兰氏阳性菌，被染成 红色的为革兰
5、氏阴性菌。7混合涂片染色按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大 肠杆菌和金黄色葡萄菌作为混合涂片、染色、镜检进行比较。实验报告：1 列表简述 3 株细菌的染色 观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。2你认为哪些环节会影响革兰 氏染色结果的正确性？最关 键的环节是什么？3现有一株细菌宽度明显大于大 肠杆菌的粗壮杆菌， 请你 鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。4你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。5进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？6革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？7你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最 终结果？在什么情况下可以采用？
