1、分子生物学 第六章,李伟 2011-10,基 因 治 疗 Gene therapy,狭义概念 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。,第一节 基因治疗的概念及其策略 一、基因治疗（ Gene therapy ）概念,广义概念 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。,1. 分子缺陷清楚 2. 可以得到相应基因的克隆 3. 病理生理机制已知 4. 有利的风险-利益比 5. 治疗基因可以被调控 6. 合适的靶细胞 7. 有效安全 8. 相关法规健全,基因治疗的必备条件：,（1）基因矫正（gene correction）对于致
2、病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能； （2）基因置换（gene replacement）用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态； （3）基因增补（gene augmentation）将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除； （4）基因表达调节（modulation ）指将特定的反义核酸、RNA干扰或核酶等技术抑制目的基因表达从而消除致病基因的作用。,第一节 基因治疗的概念及其策略 二、基因治疗的总体策略,针对致病基因而言,第一节 基因治疗的概念及其策略 二、基因治疗的总体策略,（1）自杀基因这种基因导入
3、受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药 物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。（2）免疫基因治疗将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。 （3）耐药基因治疗在肿瘤化疗过程中， 把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。 （4）More,针对非致病基因而言,第一节 基因治疗的概念及其策略 二、基因治疗的总体策略,Germ line gene therapyIn the case of germ line gene
4、therapy, Germ cells, i.e., sperm or eggs, are modified by the introduction of functional genes, which are integrated into their genomes. Therefore, the change due to therapy would be heritable and would be passed on to later generations. This new approach, theoretically, should be highly effective i
5、n counteracting genetic disorders and hereditary diseases. However, many jurisdictions prohibit this for application in human beings, at least for the present, for a variety of technical and ethical reasons. Somatic gene therapyIn the case of somatic gene therapy, the therapeutic genes are transferr
6、ed into the somatic cells of a patient. Any modifications and effects will be restricted to the individual patient only, and will not be inherited by the patients offspring or later generations.,第二节 基因治疗的基本程序,第二节 基因治疗的基本程序,第二节 基因治疗的基本程序,1. 目的基因的选择和获取 2. 目的基因与转运载体结合 3. 靶细胞的确认 4. 载体携带外源基因进入细胞 5. 外源基因的
7、整合 6. 外源基因的表达及检测 7. 治疗作用及稳定性、安全性评价,第二节 基因治疗的基本程序,在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的 特定基因。如对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基 因即可用于治疗； 对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌 基因用于基因治疗。 治疗性基因获得的方法很多： 用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取， PCR扩增，人工合成等。,第二节 基因治疗的基本程序 一、目的基因,基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。 常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。 病毒载体：逆转录病
8、毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒载体、疱疹病毒载体等 非病毒载体：裸露DNA、脂质体、分子耦联载体、染色 体载体、多聚物、纳米载体等。 ： 与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。,第二节 基因治疗的基本程序 二、转运载体,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,Safety: deletion of a part of the viral genome critical for viral replication. Such a virus can efficiently infect cells but, once the infection has taken
9、place, requires a helper virus to provide the missing proteins for production of new virions. Low toxicity: The viral vector should have a minimal effect on the physiology of the cell it infects. Stability: Some viruses are genetically unstable and can rapidly rearrange their genomes. Cell type spec
10、ificity: Most viral vectors are engineered to infect as wide a range of cell types as possible. Identification: Viral vectors are often given certain genes that help identify which cells took up the viral genes. These genes are called Markers, a common marker is antibiotic resistance to a certain an
11、tibiotic.,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（逆转录病毒载体）,逆转录病毒载体 1、逆转录病毒载体的结构,逆转录病毒载体的特点 （1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似； （2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞； （3）感染靶细胞后不扩散； （4）假病毒感染靶细胞的效率非常高； （5）不感染非增殖细胞。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（逆转录病毒载体）,同时也存在一定的缺点: 容量小，只能容纳8kb-10kb的外源基因片段； 血清补体能使之失活； 病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度； 病毒整合到DNA后，可能引起插入突变和激活癌基因的可能； 宿主范围有限
12、，只感染增殖细胞，故在应用 上有一定局限性。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（逆转录病毒载体）,慢病毒(HIV)载体 Lentivirus,优点：高效感染宿主细胞，并且其感染范围广；能逃避人体免疫系统的监视，从而防止免疫排斥,缺点：引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及对细胞的毒性和产生变种病毒,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,腺病毒载体1、结构,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,2、腺病毒载体特点 （1）宿主范围广 （2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件 （3）可获得高病毒效价 （4）重组体非常稳定 （5）不会引起肿瘤 （6）有较高的安全性 （7）无包
13、膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用 （8）不整合入染色体,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（腺病毒载体）,腺病毒表达系统与慢病毒表达系统的比较,单纯疱疹病毒载体,2、特点 （1）滴度高 （2）容量大 （3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染 （4）不整合，但可长期存在并可稳定表达,1、结构,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,痘苗病毒载体,线形双链DNA的有包膜病毒 ，其核心颗粒不依赖 宿主细胞而独立引进转录和复制，宿主范围广泛 且易于培养，容易获得高滴度的病毒颗粒。同时 痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影 响其在宿主细胞的复制能力，可允许在同一或不 同非必需区插入多个基
14、因，以表达多种或一种外源蛋白。,缺点：细胞毒性；病毒能被人体的补体系统灭活并降解,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,脂质体,脂质体载体是用人造双层磷脂质，包装DNA 后形成的脂质体-DNA复合物。脂质体载体无毒无抗原性，目的基因与脂质体的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可单独或联合其他载体使用，并可通过静脉注射使目的基因进入特定部位。 缺点：表达时间短，不能通过细胞膜屏障,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,分子耦联载体,分子耦联载体由DNA、DNA结合因子和配体三部分组成。配体与特异的受体结合，经受体介导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内。,缺点：DNA易被降解，降
15、低了基因转移效率；靶向性不高,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,多聚物载体是利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷的DNA相结合，形成稳定的多聚复合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。,多聚物载体,聚合物聚乙烯亚氨(PEI) ：PEI分子量的增加，其对细胞的转染效率和细胞毒性同时增加； 聚乙二醇(PEG) ：降低PEI的毒性 ； 聚D，L22，42二氨基丁酸(PDBA) ：一种新型多聚物基因载体,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,裸露质粒DNA,将裸露质粒DNA直接注入肌肉，外源基因在肌肉中的表达量与注入的外源基因含量成正比，与溶
16、液体积无关。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,染色体载体,一些参与哺乳动物基因表达和复制的染色体成分如转座子、基因隔离子、增强子、基因座控制区、核骨架结合区以及基质结合区等在转基因实验中，均被用来设计载体，并整合入基因组而发挥作用。转座子是一类小的DNA片段，可以在染色体不同的区域移动并携带遗传信息；转座子的整合位点具有可预测性，从而提高转基因治疗的安全性。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,细胞转导肽介导基因导入系统,蛋白质之所以能够进入细胞，就是因为在它们的结构中含有能够携带生物大分子进入细胞的多肽-细胞转导肽。如果将这个多肽结构和目的基因结合，它就能将目的基因带入靶
17、细胞。细胞转导肽的表达效率高，但价格昂贵，稳定性差，在一定程度上限制了它的应用。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（其他新型载体 ）,2. 纳米微生物技术基因治疗载体,纳米微生物具有许多优点： 1)纳米脂质体主要由磷脂以及胆固醇合成，可以通过与细胞膜 的融合或者胞吞作用将目的基因导入靶细胞； 2)纳米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在传递过 程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代谢降解，因此不 会对细胞产生毒性； 3)通过调节纳米材料的降解速度，还可以控制目的基因的释放 速度，延长其治疗效果； 4)纳米基因载体比表面积大，并可在表面偶联靶细胞的配体 或抗体，实现基因治疗的主
18、动靶向性，大大提高基因传递的 特异性和加强靶细胞对目的基因的摄取。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（其他新型载体 ）,选择靶细胞的原则是： 1）必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内； 2）具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期； 3）易于受外源遗传物质的转化； 4）在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞 。,目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、 肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。,第二节 基因治疗的基本程序 三、靶细胞的选择,干细胞 一种具有复制能力、可以形成各种组织的早期未分化细胞,1. Embr
19、yonic stem cells (ES) 胚胎干细胞45 d 胚泡内细胞团（inner cell mass of blastocyst）具有自我更新和分化为任何类型组织细胞的能力（全能性） 2. Pluripotent stem cells 多能干细胞5 10 W fetus ( Embryonic germ cells) 外层细胞胚胎等与发育相关组织内细胞团人体所有器官 3. Special stem cells 专能干细胞adult (adult stem cells, AS)hematopoietic stem cell (HSC)neural stem cell (NSC)mesen
20、chymal stem cell (MSC),骨髓干细胞骨髓 中至少含有两种干细胞：造血干细胞 Hematopoeitic stem cells（HSC）骨髓间质干细胞 Bone marrow stromal cells（MSC）HSC一般处于静止期，必要时才进入细胞周期 多能干细胞 (造血干细胞, HSC)红系祖细胞定向干细胞 (造血祖细胞, HPC) 巨核系祖细胞单核系祖细胞成熟的终末细胞,1）具有可移植性和自我更新能力，在体内永不耗竭，只需单次治疗；2）具有多能性，可分化为粒、红、淋巴和血小板等各种血细胞，且在分化过程中保持基因组的相对稳定，使目的基因随细胞的分化成熟而相对扩增，病人可终
21、身受益；3）外源基因表达产物可通过血液循环遍布全身；4）造血干/祖细胞的功能活性可在体内外进行分析；5）取材于自体骨髓或脐带血，易于获取也便于植回并存活，临床已有成熟技术,骨髓中的非造血干细胞，能分化成多种中胚层来源的间质 细胞（骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等）MSC在体内可定向成骨、成软骨或成肌腱分化，可能是不 同组织的微环境含有不同因子，促进MSC向不同谱系分化。MSC体外易于分离和培养，回输体内后可定位于骨髓并通 过自我更新而长期存活，因而可作为理想的靶细胞用于基因 治疗（直接移植MSC可治疗骨和软骨的疾病）,骨髓间质干细胞,成纤维细胞是一种容易获得和在体外培养并进行遗传修饰的细胞
22、。经修饰的细胞又容易移植回体内，必要时还可将已植入的细胞重新移走，使其介导的基因治疗终止。 已有多种细胞因子基因被转移到小鼠皮肤成纤维细胞，然后再移植回小鼠。这些细胞再体内持续分泌细胞因子，使小鼠对肿瘤的免疫功能明显增强。,成纤维细胞,遗传修饰后的成纤维细胞也可移植入脑内，以治疗神经系统疾病 国内薛京伦等以逆转录病毒为载体，将人凝血因子IX cDNA 在体外转移到两例血友病患者的皮肤成纤维细胞中，用胶原基质包埋后再自体移植回体内，结果IX因子在体内持续高水平表达2年以上，使两患者的出血症状得到不同程度减轻。,骨骼肌优点：最常用的注射途径，对外源药物耐受力强；面广量大又位于体表易于操作，是表达外
23、源基因的良好场所。,肌细胞,外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte，PBL）主要优点：1. 易于从体内取出和回输。应用IL-2尚可使PBL在体外 进行培养并扩增，从而获得足够数量以适应体外操作。2. PBL对目前常用的RV, AAV 等都有一定敏感度，可被有效导入外源基因，并可耐受筛选。3. 筛选出转导成功的细胞回输体内可继续存活，应用IL-2可使之继续生长且有功能。 世界上首例遗传病的基因治疗：ADA缺乏症（SCID）,淋巴细胞,化学方法物理方法膜融合法 病毒载体法 质粒DNA直接转移法,磷酸钙法 DEAE葡聚糖法,电穿孔法 粒子轰击法（基因枪法）,第二节 基
24、因治疗的基本程序 四、载体携带外源基因进入细胞,第二节 基因治疗的基本程序 五、外源基因的整合,不整合 整合 随机整合 定点整合,第二节 基因治疗的基本程序 六、外源基因的表达及检测,（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于外源基因的整合分析。,（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。,（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,第二节 基因治疗的基本程序 七、有效性、稳定性和安全性评价,动物模型 临床试验,第三节、基因治疗的现状,进行基因治疗必须具备下列条件： 1)
25、选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚； 2)纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件； 3)该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达； 4)具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。,1991年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功 1992年实施了TNF肿瘤细胞和IL2/肿瘤细胞方案，即分别将IL2基因肿瘤坏死因子（tumor necrosis rector， TNF）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90%的肿瘤消退，另2人
26、在治疗后9个月死亡。 我国也在1994年用导入人凝血因子基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者 对一些遗传病如血友病，地中海贫血、高雪氏病等正在探索中。,第三节、基因治疗的现状,ADA-Gene + vector （逆转录病毒） 重组分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 导入 细胞生长分裂10天Gene表达回输患儿体内12月治疗一次, 10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%,第三节、基因治疗的现状 一、复合免疫缺陷综合征的基因治疗,XR ，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3-q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。 例如：
27、我国学者薛京伦实施的F的基因治疗。,第三节、基因治疗的现状 二、乙型血友病,逆转录病毒载体 +FcDNA重组体5 LTR F neo SV PSO LTR 3 导入仓鼠细胞（CHO）F表达； 导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞F表达； 91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞回植病人皮下F基因表达，F基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。,第三节、基因治疗的现状 二、乙型血友病,IL-2 Gene TNF-Gene（白介2） （肿瘤坏死因子） 逆转录病毒载体 导入TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞 的作用。,第三节、基因治疗的现
28、状 三、黑色素瘤的基因治疗,是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因 的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段，使编码 蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应 的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的,第三节、基因治疗的现状 四、反义技术,第三节、基因治疗的现状 四、反义技术,第三节、基因治疗的现状 五、药物靶向治疗,第四节、基因治疗的靶向性,靶向性基因载体的作用原理,靶向性是指在治疗过程中，把治疗作用或药物 效应限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而 不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能。 靶向性载体在这里不仅仅起一个靶向作用，还 要通过各自的不同作用力和DNA分子链结合形成 一个相
29、对紧密的复合物粒子，使其更容易穿过 细胞膜并且免受核酸酶的降解。,三个步骤： 1.靶向性载体和目的基因以适当比例混合，通过静电 荷力、分子间作用力等结合力结合在一起，使链状的DNA分 子折叠，形成粒状的复合物。 2. 复合物在靶向性基团的引导下接近靶细胞，通过细胞的 内吞或者吞噬作用进入细胞内部，在细胞内紧密的复合物 可以保护DNA避免核酸酶的降解。 3. 靶向性载体和目的基因脱离，目的基因通过核膜孔或者 是在细胞分裂过程中进入细胞核，修补缺失基因或者关闭 异常基因， 而靶向性载体则分解成小分子化合物通过细胞 的新陈代谢排出细胞。,第四节、基因治疗的靶向性 一、靶向性基因载体的作用原理,理想的
30、基因载体应具备以下特点： 1)靶向特异性，并且可被免疫系统识别； 2)高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化； 3)安全，无毒性，对人体以及环境无危害； 4)有利于基因高效转移和长期表达。,第四节、基因治疗的靶向性 二、靶向性基因载体的选择,在携带目的基因进入靶细胞后，某些基因载体 并不能马上分解，滞留在细胞内影响细胞正常 的新陈代谢，甚至引起基因突变从而杀死正常 细胞乃至对人体的生命安全产生危害。 尤其是病毒载体，存在着较为明显的安全问题： 病毒载体中可能产生有传染性、野型或辅助型 病毒；可能随机整合于宿主基因组中，从而活 化癌基因或抑制癌基因失活；病毒载体自身或 编码的基因产物过度表达。,第四节
31、、基因治疗的靶向性 二、靶向性基因载体的选择,靶向性基因载体的安全性,首先是基因转移的有效性，通过靶向递送技术将目的基因尽可能多地导入靶细胞； 其次是基因转录的有效性，通过使用组织特异性或疾病状态下过表达基因调控元件控制基因在靶细胞内转录； 第三是基因表达时间和水平上的有效性，应用人工合成可调控表达系统来操纵基因表达，使其一方面在一定时区表达，另一方面表达水平不至于过高过低，尽可能地满足治疗需要。,第四节、基因治疗的靶向性 二、靶向性基因载体的选择,靶向性基因载体的有效性,第五节、基因治疗存在的问题,1.导入基因的稳定高效表达；选择合适的转移方法；选择适当的受体细胞。 2.导入基因的安全性；一
32、方面应构建相对安全的反转录病毒载体；另一方面，应寻找更安全的非病毒载体；体细胞基因治疗 3.基因治疗与社会伦理道德 。,为安全起见，在临床试验之前，必须在动物研究中 达到三项基本要求： 1)外源的基因能导入靶细胞并维持足够长期有效； 2)该基因要以足够的水平在细胞中表达； 3)该基因应对细胞无害。,第五节、基因治疗存在的问题 一、导入基因的安全性,体细胞Gene治疗符合伦理道德，没有争议。生殖细胞Gene治疗可能改变正常人的遗传特征，存在某些争议。然而生殖细胞的基因治疗又是一个不容回避的课题，因为它比体细胞基因治疗更为彻底。所以，随着分子生物学技术的发展，Gene治疗技术的成熟，将回答伦理道德
33、方面的问题，相信生殖细胞的基因治疗将会被人们接受。,第五节、基因治疗存在的问题 二、Gene治疗与社会伦理道德,1、单基因缺陷疾病2、仅限体细胞的基因治疗3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。4、治疗效果应胜过对病人的危害。5、表达水平无需调控且无副作用。6、需经动物实验验证安全可行。,第六节、基因治疗产业的未来展望 一、基因治疗应满足的条件,1、难以获得真正有治疗作用的基因。 2、外源基因的表达难以在体内精确调控。3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有 改变。4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。5、随机整合潜在的威胁。,第六节、基因治疗产业的未来展望 二、基因治疗有待解决的问题,目前基因治疗的大门已打开，一旦世界上第一个 基因治疗产品被商业化推出，基因治疗行业将迅 速形成巨大的市场，成为二十一世纪新的经济增 长点。这种成功将带来巨大的社会效益和经济效益。,第六节、基因治疗产业的未来展望 三、基因治疗产业的未来展望,
