辣根过氧化物酶_HRP_底物的研究进展_戚红卷.pdf

1、收 稿 日 期 2007 - 06 - 19基 金 项 目 军 队 科 技 攻 关 计 划 资 助 项 目 (06G120)作 者 简 介 戚 红 卷 (1977 - ) ,男 ,河 南 省 夏 邑 县 人 ,在 读 博 士生 。3 通 讯 联 系 人 , Email: sqwang bm i. ac. cn辣 根 过 氧 化 物 酶 ( HRP)底 物 的 研 究 进 展戚 红 卷 , 陈 苏 红 , 王 升 启 3(军 事 医 学 科 学 院 放 射 与 辐 射 医 学 研 究 所 ,北 京 100850)摘 要 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP)在 酶 免 疫 分 析 中 得 到 广

2、 泛 应 用 。 本 文 综 述 了 三 类 主 要 的 HRP底 物 :色 原 底 物 、 荧光 底 物 和 化 学 发 光 底 物 的 研 究 进 展 ,介 绍 了 相 应 的 各 种 检 测 方 法 的 优 缺 点 和 实 际 应 用 ,对 其 他 HRP底 物 的 研 究 前沿 也 进 行 了 探 讨 ,指 出 一 种 包 含 巯 基 和 酚 基 的 纳 米 金 作 为 新 型 的 HRP底 物 ,具 有 灵 敏 度 高 、 检 测 成 本 低 、 信 号 值 恒定 等 一 系 列 突 出 优 点 ,在 免 疫 组 化 、 基 因 芯 片 等 领 域 展 现 出 广 阔 的 应 用 前

3、 景 。关 键 词 HRP底 物 ;色 原 ;荧 光 ;化 学 发 光 ;纳 米 金中 图 分 类 号 Q554 文 献 标 识 码 A文 章 编 号 100025501 (2007) 0620560204HRP substra tes and the ir research progressQ I Hong2Juan, CHEN Su2Hong, WAN G Sheng2Q i3( Institute of Radiation Medicine, Academy ofM ilitary Medical Sciences, Beijing 100850, China) Abstract HRP

4、 has been widely used in enzyme immunoassay( E IA). Here we review the recent p rogress in three mainHRP substrates including chromogens, fluorescent subtrate and chem ilum inescent substrate. In this review, advantages,disadvantages and app lications of corresponding detection methods are summarize

5、d. In addition, p ioneer research on otherHRP substrates is also considered. A s a novel HRP substrate, nanogold containing thiol and phenolic group has some ad2vantages such as high sensitivity, low detection expenses and permanent record of signals, etc, which p rom ise its broad po2tential use in

6、 immunohistochem istry, DNA m icroarrays and other related fields. Key words HRP substrate; chromogens; fluorescence; chem ilum inescence; nanogold用 酶 标 记 各 种 特 异 性 配 体 (抗 体 、 抗 原 等 ) ,利 用 酶 的 催化 放 大 作 用 和 特 异 性 作 用 而 建 立 的 标 记 免 疫 分 析 叫 做 酶 免疫 分 析 ( enzyme immunoassay, E IA ) 1 。 在 酶 免 疫 分 析 中 将在 酶

7、 催 化 作 用 下 产 生 新 化 合 物 的 物 质 统 称 为 底 物 。 一 种 酶能 催 化 特 定 的 底 物 ,将 其 转 化 为 有 可 检 测 信 号 的 产 物 。 酶 仅使 底 物 转 化 为 产 物 ,本 身 在 反 应 过 程 中 并 不 消 耗 ,反 复 起 催化 作 用 ,将 信 号 放 大 。 传 统 的 E IA采 用 色 原 底 物 测 量 可 见 光的 吸 光 度 ,随 着 酶 免 疫 分 析 技 术 的 发 展 ,出 现 了 灵 敏 度 更 高的 放 射 性 底 物 、 荧 光 底 物 和 化 学 发 光 底 物 ,而 改 为 测 量 释 放的 射 线

8、、 荧 光 和 化 学 发 光 。 由 于 采 用 放 射 性 底 物 存 在 接 触 和处 理 放 射 性 物 质 的 危 险 ,而 随 后 出 现 的 荧 光 和 化 学 发 光 检 测的 灵 敏 度 已 经 达 到 或 超 过 该 方 法 ,因 此 放 射 性 底 物 出 现 后 不久 即 很 少 使 用 。 目 前 常 用 于 E IA的 酶 包 括 如 下 3种 :辣 根 过氧 化 物 酶 ( horseradish peroxidase, HRP)、 碱 性 磷 酸 酶 ( alka2line phosphatase, AP)及 2D2半 乳 糖 苷 酶 ( 2D2galactos

9、idase,GAL)。 其 中 HRP分 子 最 小 、 易 于 与 蛋 白 耦 联 ,而 且 呈 色 性好 ,应 用 最 为 广 泛 ,因 此 对 HRP底 物 的 研 究 在 基 于 酶 的 分 析检 测 中 具 有 非 常 重 要 的 意 义 。 本 文 对 近 年 来 HRP底 物 的 研究 进 展 作 一 综 述 。1 色 原 底 物最 早 的 HRP底 物 是 色 原 ,常 规 的 色 原 底 物 在 酶 作 用 下产 生 一 种 新 的 颜 色 (或 者 吸 收 光 谱 发 生 改 变 ) ,这 种 检 测 方法 的 优 点 在 于 产 生 的 颜 色 很 容 易 用 肉 眼 或

10、 光 谱 仪 器 检 测 ,检测 仪 器 的 价 格 一 般 也 比 其 他 检 测 方 法 所 用 的 仪 器 便 宜 ;缺 点是 检 测 灵 敏 度 普 遍 低 于 其 他 酶 检 测 方 法 。色 原 底 物 的 基 本 结 构 可 用 变 化 多 样 的 芳 香 族 胺 和 酚 表示 ,大 多 数 芳 香 胺 、 酚 和 它 们 的 混 合 物 在 酶 促 氧 化 时 会 产 生有 色 的 缩 聚 物 。 常 见 的 芳 胺 类 色 原 底 物 包 括 :邻 苯 二 胺(OPD)、 四 甲 基 联 苯 胺 ( TMB)、 2, 2 2连 氮 2双 2(32乙 基 苯 噻 唑啉 262磺

11、 酸 ) (ABTS)、 52氨 基 水 杨 酸 ( 52AS)、 邻 联 二 茴 香 胺(ODA)、 邻 联 甲 苯 胺 (OT)等 1 。 部 分 色 原 底 物 的 分 子 结 构式 见 图 1。065 军 事 医 学 科 学 院 院 刊 2007年 12月 第 31卷 第 6期Bull Acad M il Med Sci, Dec 2007; Vol 31 No 6 图 1 部 分 色 原 底 物 的 分 子 结 构 式32氨 基 292乙 基 咔 唑 (AEC)和 3, 62二 氨 基 292乙 基 咔 唑 常用 于 过 氧 化 物 酶 的 活 性 染 色 。 Krieg等 2 将

12、AEC连 接 螯 合的 N2苄 基 部 分 ,得 到 一 类 新 型 的 N2芳 基 甲 基 2苯 胺 色 原 底 物(通 用 结 构 式 见 图 2)。 其 制 备 方 法 是 将 AEC或 3, 62二 氨 基 292乙 基 咔 唑 与 芳 香 醛 混 合 浓 缩 ,随 后 将 浓 缩 产 物 Schiff碱 用NaBH4还 原 即 可 。 与 传 统 的 芳 胺 类 色 原 底 物 相 比 ,这 种 新 型底 物 的 灵 敏 度 和 适 用 性 等 得 到 很 大 改 进 。图 2 32( N2芳 基 甲 基 )氨 基 292乙 基 咔 唑 (X =OH, NHR)2 荧 光 底 物与

13、色 原 底 物 相 比 ,荧 光 底 物 检 测 灵 敏 度 高 ,而 且 可 以 同时 采 用 几 种 不 同 颜 色 的 荧 光 材 料 ;但 是 荧 光 底 物 存 在 以 下 缺点 :激 发 和 检 测 荧 光 需 要 价 格 昂 贵 的 光 源 、 过 滤 器 和 扫 描 仪 ,检 测 成 本 高 ;荧 光 在 观 测 期 间 或 样 品 存 放 期 间 、 甚 至 暴 露 于室 内 光 线 时 都 会 衰 减 ,导 致 难 以 获 得 恒 定 值 或 定 量 数 据 ;另外 从 细 胞 和 其 他 分 子 里 产 生 的 自 发 荧 光 (在 许 多 活 体 中 天 然存 在 的

14、某 些 特 定 化 合 物 产 生 的 荧 光 )也 会 对 实 验 结 果 产 生 干扰 。常 规 的 荧 光 材 料 难 以 直 接 用 作 HRP底 物 ,但 是 它 们 与酪 胺 4 - (22氨 乙 基 ) - 苯 酚 耦 联 后 却 可 以 在 HRP作 用 下发 生 沉 积 。 这 种 基 于 酪 胺 的 荧 光 色 素 沉 积 技 术 的 正 式 名 称叫 催 化 报 道 分 子 沉 积 ( catalyzed reporter deposition, CARD ) ,或 者 酪 胺 信 号 放 大 ( tyram ine signal amp lification, TSA)

15、。 该 技术 是 由 Bobrow等 3 于 1989年 首 次 提 出 的 ,其 应 用 范 围 开 始仅 限 于 免 疫 印 迹 和 EL ISA分 析 ,后 来 则 延 伸 到 免 疫 组 化 、 原位 杂 交 等 诸 多 领 域 ,在 基 于 酶 的 灵 敏 检 测 中 得 到 广 泛 的 应用 4 6 。CARD的 基 本 检 测 过 程 包 括 以 下 几 个 步 骤 :首 先 使 用 生物 素 化 的 抗 体 或 核 酸 探 针 ,通 过 蛋 白 质 或 核 酸 的 结 合 来 检 测靶 标 的 存 在 ;接 着 引 入 链 酶 亲 合 素 2HRP耦 联 试 剂 ,链 酶 亲

16、合素 与 生 物 素 特 异 结 合 ;最 后 引 入 荧 光 标 记 的 酪 胺 底 物 ,在HRP作 用 下 ,酪 胺 的 酚 基 发 生 反 应 形 成 自 由 基 中 间 体 ,该 中间 体 与 周 围 的 物 质 快 速 反 应 ,从 而 将 荧 光 材 料 沉 积 或 固 定 在附 近 区 域 。 这 个 过 程 通 过 供 给 更 多 的 底 物 (荧 光 素 化 酪 胺 )而 重 复 进 行 ,在 局 限 区 域 内 积 聚 起 更 多 的 荧 光 材 料 ,最 后 通过 激 发 扫 描 即 可 实 现 高 灵 敏 度 的 荧 光 检 测 。 用 于 标 记 酪 胺的 常 见

17、荧 光 材 料 包 括 :荧 光 素 ( F ITC)、 青 色 素 (Cy3、 Cy5)等 。与 CARD中 荧 光 分 子 只 有 通 过 与 酪 胺 形 成 复 合 物 才 能被 HRP催 化 沉 积 不 同 , Krieg等 7 合 成 了 一 类 22( 22苯 乙 烯基 ) 2苯 并 噻 唑 衍 生 物 ,这 类 化 合 物 可 以 作 为 新 型 荧 光 底 物 直接 用 于 HRP的 活 性 定 位 ,其 基 本 结 构 式 见 图 3。 经 过 优 化 筛选 ,其 中 ( E) 22222 42羟 苯 基 乙 烯 基 232乙 基 21, 32苯 并 噻 唑 碘化 物 的 效

18、 果 最 好 ,与 A lexa荧 光 素 5462酪 胺 偶 合 物 相 比 ,这 种新 型 的 底 物 荧 光 染 色 特 异 性 强 、 灵 敏 度 高 、 背 景 低 。 总 之 ,通过 将 苯 乙 烯 基 苯 并 噻 唑 衍 生 物 进 行 酶 交 联 从 而 在 HRP活 性位 点 附 近 产 生 多 重 荧 光 色 素 ,是 一 种 可 以 替 代 荧 光 染 料 标 记酪 胺 沉 积 技 术 的 很 有 前 景 的 方 法 。图 3 22( 22苯 乙 烯 基 ) 2苯 并 噻 唑3 化 学 发 光 底 物化 学 发 光 是 指 伴 随 化 学 反 应 过 程 所 产 生 的

19、光 的 发 射 现象 。 化 学 发 光 与 荧 光 的 区 别 是 形 成 激 发 态 分 子 的 激 发 能 不同 ,荧 光 是 吸 收 了 光 能 使 分 子 激 发 而 发 射 的 光 ,化 学 发 光 则是 吸 收 了 化 学 反 应 过 程 中 所 产 生 的 化 学 能 使 分 子 激 发 而 发射 的 光 。 化 学 发 光 底 物 一 般 具 有 高 化 学 键 能 ,在 酶 的 作 用 下化 学 键 断 裂 ,能 量 释 放 出 来 形 成 可 见 光 。 图 4展 示 了 一 种 化学 发 光 底 物 鲁 米 诺 的 发 光 机 制 。 信 号 采 用 光 电 倍 增 管

20、 、 雪崩 二 极 管 或 其 他 灵 敏 的 光 学 检 测 器 检 测 ,或 者 采 用 照 相 胶 片显 影 。 化 学 发 光 检 测 灵 敏 度 高 、 背 景 低 ,因 而 得 到 广 泛 应 用 。但 是 这 种 方 法 也 存 在 很 多 缺 点 :检 测 仪 器 价 格 昂 贵 ,采 用 胶片 显 影 又 不 方 便 ;发 射 光 必 须 随 时 采 集 ,导 致 难 以 得 到 恒 定值 数 据 ;要 实 现 高 灵 敏 度 检 测 ,需 要 长 达 数 小 时 甚 至 1 d的 光积 分 时 间 等 。165 军 事 医 学 科 学 院 院 刊 2007年 12月 第 3

21、1卷 第 6期图 4 鲁 米 诺 的 化 学 发 光 反 应 机 制化 学 发 光 物 质 大 多 是 有 机 化 合 物 ,它 作 为 氧 化 反 应 的 底物 ,在 反 应 中 转 变 为 激 发 态 分 子 。 常 用 的 化 学 发 光 底 物 包 括以 下 四 类 : 酰 肼 类 ,如 鲁 米 诺 (32氨 基 苯 二 甲 酰 肼 ) ,异 鲁 米诺 (42氨 基 苯 二 甲 酰 肼 )及 其 衍 生 物 ; 咪 唑 类 ,较 常 用 的 是2, 4, 52三 苯 基 咪 唑 ,俗 称 洛 酚 碱 ; 吖 啶 盐 类 ,最 为 常 用 的是 N, N2二 甲 基 吖 啶 硝 酸 盐

22、(俗 称 光 泽 精 ) ; 草 酸 盐 类 ,该类 化 合 物 本 身 不 是 有 效 的 化 学 发 光 剂 ,它 和 H2 O2反 应 生 成过 氧 化 物 中 间 体 ,而 这 种 中 间 体 是 一 个 最 佳 的 化 学 发 光 关 键性 中 间 体 ,它 能 释 放 出 较 多 的 能 量 ,此 能 量 可 转 移 至 加 入 反应 体 系 的 另 一 种 物 质 的 分 子 ,使 这 种 物 质 的 分 子 激 发 而 发光 。 这 类 化 学 发 光 反 应 的 发 光 效 率 很 高 ,例 如 双 2( 2, 4, 62三 氯 基 苯 )草 酸 盐 ( TCPO) 8 。近

23、 年 来 有 研 究 小 组 陆 续 报 道 了 一 些 新 型 化 学 发 光 底 物并 成 功 地 应 用 到 实 际 检 测 中 。 Ichibangase等 9 以 22(42羟 苯基 ) 24, 52二 苯 基 咪 唑 (HD I)的 月 桂 酸 酯 为 底 物 ,发 展 了 一 种用 于 测 定 脂 肪 酶 (三 酰 基 甘 油 脂 酶 )活 性 的 新 型 化 学 发 光 分析 方 法 ,该 方 法 是 基 于 氨 基 苯 二 酰 肼 2H2 O2 2HRP与 通 过 酶 水解 底 物 而 产 生 的 HD I发 生 增 强 的 化 学 发 光 反 应 。 Yakovleva等

24、10 将 亲 合 蛋 白 通 过 共 价 键 固 定 在 硅 基 芯 片 上 ,开 发 了 一种 基 于 HRP催 化 鲁 米 诺 /对 碘 酚 的 复 合 物 化 学 发 光 氧 化 的微 流 路 免 疫 传 感 器 ,采 用 带 有 长 柔 性 链 的 各 种 亲 水 性 聚 合 物(如 聚 乙 烯 亚 胺 、 葡 聚 糖 、 聚 乙 烯 醇 等 )对 硅 基 表 面 进 行 修 饰 ,随 后 连 接 蛋 白 A或 G。 为 了 识 别 和 控 制 在 细 胞 和 聚 合 材 料之 间 界 面 的 配 体 2受 体 相 互 作 用 , Takei等 11 研 究 了 一 种 水 相介 质

25、中 的 模 式 系 统 ,这 种 系 统 以 HRP为 酶 ,以 42氨 酰 安 替 比林 (AAP)和 32(对 2羟 苯 基 )丙 酸 ( HPPA )作 为 底 物 。 Tang等 12 合 成 1, 52bis ( p2hydroxybenzaldene ) thiocarbohydrazone(BHBTZ) 作 为 一 种 新 型 HRP 底 物 ,实 验 显 示 抗 坏 血 酸(A sA)对 BHBTZ2H2O2 2HRP反 应 系 统 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 ,因 此 将 A sA作 为 酶 抑 制 方 法 的 抑 制 剂 进 行 了 分 光 光 度 测 定 ,该 方

26、 法 成 功 地 应 用 于 茶 饮 料 中 A sA的 测 定 。4 纳 米 金 底 物纳 米 金 是 指 直 径 在 1 100 nm尺 寸 的 微 小 金 颗 粒 ,一 般以 分 散 在 水 中 的 溶 胶 形 式 存 在 ,因 而 也 称 胶 体 金 。 纳 米 金 具有 表 面 效 应 、 小 尺 寸 效 应 、 宏 观 量 子 隧 道 效 应 等 独 特 的 物 理化 学 性 质 以 及 良 好 的 生 物 相 容 性 ,因 此 非 常 适 合 于 生 物 大 分子 的 标 记 和 检 测 13 。 但 是 这 种 胶 体 形 式 的 纳 米 金 存 在 一 些固 有 的 缺 点

27、:颗 粒 大 小 不 一 、 易 凝 集 、 与 生 物 分 子 以 静 电 吸 附结 合 ,标 记 不 稳 定 且 假 阳 性 率 高 等 。 为 了 克 服 这 些 缺 点 ,近年 来 美 国 Nanop robes公 司 开 发 了 一 种 新 型 的 纳 米 金 颗 粒 并命 名 为 “ nanogold” ,该 颗 粒 是 以 一 个 包 含 大 约 67个 金 原 子 的簇 化 物 为 核 心 的 复 合 体 ,通 过 位 于 其 表 面 的 金 原 子 与 三 芳 基磷 配 基 或 卤 化 物 离 子 结 合 而 形 成 稳 定 的 纳 米 金 分 子 ,其 中 心粒 径 仅 1

28、. 4 nm,表 面 不 带 电 荷 ,在 溶 液 中 呈 离 散 状 态 。 这 种新 型 的 纳 米 金 与 胶 体 金 相 比 有 诸 多 优 点 : 颗 粒 小 且 均 匀 一致 、 标 记 密 度 高 、 穿 透 性 好 ; 经 特 定 基 团 修 饰 后 可 以 与 生 物分 子 以 共 价 键 结 合 ,使 得 标 记 分 子 高 度 稳 定 ; 颗 粒 表 面 不带 电 荷 ,因 此 不 易 凝 集 ,适 用 于 很 宽 的 pH范 围 和 离 子 强 度中 ,等 等 。 由 于 nanogold的 上 述 优 点 ,因 此 一 经 出 现 便 迅 速应 用 到 原 位 杂 交

29、 、 免 疫 组 化 、 W estern印 迹 检 测 法 等 生 物 医 学检 测 的 众 多 领 域 14 16 。纳 米 金 用 于 生 物 检 测 的 研 究 已 有 接 近 一 个 世 纪 的 历 史 ,20世 纪 80年 代 初 免 疫 金 银 染 色 ( immuno2gold2silver staining,IGSS)技 术 的 出 现 是 纳 米 金 应 用 于 生 物 检 测 的 里 程 碑 17 。该 技 术 首 先 用 纳 米 金 标 记 待 检 的 抗 体 或 抗 原 ,然 后 在 体 系 中引 入 银 离 子 。 小 尺 寸 效 应 使 纳 米 金 颗 粒 具 有

30、 很 强 的 催 化 还原 作 用 ,可 以 将 周 围 的 银 离 子 还 原 成 银 颗 粒 ;而 这 些 银 颗 粒又 可 以 进 一 步 催 化 还 原 周 围 的 银 离 子 。 这 种 级 联 瀑 布 催 化作 用 使 得 银 颗 粒 越 聚 越 多 ,紧 紧 包 裹 纳 米 金 颗 粒 积 聚 成 团 状银 壳 ,形 成 几 乎 肉 眼 可 见 的 黑 色 颗 粒 ,用 普 通 电 镜 甚 至 肉 眼即 可 观 测 。 IGSS的 检 测 成 本 远 低 于 荧 光 和 化 学 发 光 检 测 ,与色 原 检 测 相 比 又 显 著 提 高 了 灵 敏 度 ,因 此 很 快 得

31、到 广 泛 应用 。为 了 提 高 IGSS的 检 测 灵 敏 度 ,使 之 适 用 于 检 测 组 织 中的 稀 有 抗 原 。 Lee等 18 将 IGSS与 免 疫 组 化 中 广 泛 应 用 的TSA技 术 进 行 了 结 合 。 检 测 流 程 是 首 先 将 待 检 组 织 进 行 固定 和 封 闭 ;然 后 依 次 加 入 一 抗 、 生 物 素 化 二 抗 、 链 酶 亲 合 素 标记 的 HRP、 生 物 素 标 记 的 酪 胺 以 及 链 酶 亲 合 素 标 记 的 纳 米金 ,并 分 别 在 加 入 各 步 试 剂 后 温 育 ,最 后 加 入 银 增 强 试 剂 染色

32、;样 本 同 时 采 用 IGSS检 测 ,即 在 加 生 物 素 化 二 抗 温 育 后 直接 加 链 酶 亲 合 素 标 记 的 纳 米 金 ,然 后 银 染 。 用 电 镜 观 察 两 种检 测 流 程 的 组 织 切 片 并 进 行 比 较 ,结 果 显 示 IGSS与 TSA结合 大 幅 度 提 高 了 标 记 密 度 和 检 测 灵 敏 度 。 但 由 于 纳 米 金 必须 通 过 两 步 反 应 才 能 沉 积 ,即 HRP首 先 催 化 生 物 素 化 酪 胺反 应 以 及 随 后 生 物 素 与 链 酶 亲 合 素 2纳 米 金 结 合 ,因 此 检 测过 程 相 对 繁 琐

33、 。Hainfeld等 19 制 备 了 一 种 包 含 有 机 配 基 的 新 型 纳 米 金 ,它 的 最 大 特 点 是 可 以 直 接 被 HRP催 化 沉 积 ,因 此 可 以 作 为一 种 新 的 HRP底 物 。 制 备 方 法 是 首 先 将 金 盐 用 水 溶 解 ,接着 将 谷 胱 甘 肽 和 对 羟 基 苯 硫 酚 加 入 金 盐 水 溶 液 ,最 后 加 入NaBH4还 原 即 可 。 产 物 用 凝 胶 过 滤 色 谱 纯 化 。 通 过 控 制 反265 军 事 医 学 科 学 院 院 刊 2007年 12月 第 31卷 第 6期 应 条 件 ,得 到 了 粒 径

34、范 围 在 1 3 nm (标 称 1. 4 nm )、 含 有 酚基 和 巯 基 的 纳 米 金 颗 粒 。 Ga tan等 20 将 这 种 纳 米 金 底 物 作为 探 针 ,用 于 免 疫 组 化 中 稀 有 组 织 抗 原 的 标 记 与 检 测 。 结 果显 示 ,与 IGSS结 合 TSA以 及 非 放 大 IGSS相 比 , HRP催 化 纳米 金 底 物 沉 积 ,然 后 银 染 的 流 程 得 到 了 最 高 的 检 测 灵 敏 度 和特 异 性 ,而 且 比 IGSS结 合 TSA的 方 法 简 化 了 检 测 流 程 ,更 适合 于 稀 有 抗 原 或 微 量 核 酸

35、等 生 物 样 本 的 高 灵 敏 度 检 测 。5 展 望HRP在 酶 免 疫 分 析 中 占 有 重 要 地 位 。 在 前 述 的 三 类 主要 HRP底 物 中 ,早 期 的 色 原 底 物 检 测 灵 敏 度 不 高 ,随 后 发 展起 来 的 荧 光 底 物 和 化 学 发 光 底 物 显 著 提 高 了 灵 敏 度 ,但 面 临的 共 同 问 题 是 检 测 仪 器 价 格 昂 贵 ,从 而 限 制 了 其 应 用 。 另 外这 两 种 底 物 自 身 也 都 存 在 一 些 缺 陷 :荧 光 信 号 易 饱 和 、 易 猝灭 ,以 及 自 发 荧 光 对 实 验 结 果 产 生

36、 干 扰 ;化 学 发 光 必 须 随 时采 集 ,光 积 分 时 间 长 等 。 与 之 相 比 ,纳 米 金 底 物 具 有 一 系 列突 出 优 点 :灵 敏 度 高 ,纳 米 金 颗 粒 的 消 光 系 数 比 色 原 底 物 和荧 光 基 团 高 大 约 1 000倍 ;检 测 成 本 低 ,采 用 电 镜 甚 至 目 视 即可 检 测 ;沉 积 金 属 非 常 稳 定 ,使 检 测 信 号 容 易 得 到 恒 定 值 ,等等 。 纳 米 金 底 物 已 经 作 为 新 型 的 标 记 探 针 ,用 于 免 疫 组 化 中稀 有 组 织 抗 原 的 高 灵 敏 度 检 测 。基 因

37、芯 片 是 基 于 核 酸 互 补 杂 交 的 原 理 而 发 展 起 来 的 一项 生 物 高 新 技 术 ,是 高 效 大 规 模 获 取 生 物 信 息 的 重 要 手 段 ,在 基 因 表 达 谱 研 究 、 疾 病 分 子 检 测 和 大 规 模 药 物 筛 选 等 许 多领 域 具 有 广 泛 的 用 途 。 荧 光 检 测 是 基 因 芯 片 的 常 规 检 测 方法 ,因 此 存 在 检 测 仪 器 价 格 昂 贵 、 荧 光 猝 灭 、 自 发 荧 光 等 一 系列 缺 点 。 近 几 年 ,已 经 有 研 究 小 组 将 金 银 染 色 技 术 用 于 基 因芯 片 的 可

38、 视 化 检 测 ,但 缺 点 是 灵 敏 度 低 ,不 能 满 足 分 子 检 测的 要 求 21, 22 。 将 HRP催 化 纳 米 金 底 物 沉 积 并 附 加 银 染 的方 法 用 于 基 因 芯 片 的 信 号 检 测 ,将 会 大 幅 度 提 高 可 视 化 检 测的 灵 敏 度 ,实 现 基 因 芯 片 的 高 灵 敏 度 可 视 化 检 测 。 该 方 法 将突 破 荧 光 检 测 成 本 高 导 致 基 因 芯 片 技 术 难 以 推 广 的 瓶 颈 ,展现 出 广 阔 的 应 用 前 景 。参 考 文 献 1 尹 伯 元 ,王 仁 芝 ,李 振 甲 ,主 编 . 标 记

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