1、1分枝杆菌电转化分为慢速生长型分枝杆菌(如 Tice BCG/M. M/H37Ra/H37Rv 菌等)及快速生长型分枝杆菌( 如 M.smegmatice 菌等) 。Scheme：慢速生长型分枝杆菌电转程序：注意：也可以采用菌落转化：取新鲜的菌落，约两满板，刮到含有玻璃珠的 50ml 离心管，要充分打碎，打散！剧烈震荡至少 5X5min。然后用 10%甘油洗涤 3 遍，其余同下面的转化。 1. 需要准备的材料：1) 10% 甘油+0.05% Tween 80 20ml 甘油+180 毫升水+100ul Tween 80，并用 0.2m 滤器过滤。要求新鲜配制，不得超过 1 周2) 灭菌的玻璃珠
2、，50ml 离心管，Bio-rad 于 0.2cm 的电转杯，25-ml 移液管。3) 50ml 长好的对数期的菌液菌液的 OD 值，达到 0.5-1.0。带滤芯的 1ml枪尖。2. 程序：1) 将待转菌接种至含有 50 mL 7H9(含 0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，37 度摇菌扩增（对 M. marinum， M. ulcerans 是 28-30 度） 。冻存甘油菌需要先加到含有 5ml 培养基的 50ml 离心管复壮，待长起之后，需取2ml，接种到含含有 50 mL 7H9(含 0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中；2菌落需取很多加入含有 50 mL
3、 7H9(含 0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，同时锥形瓶中需加入 10 颗左右的玻璃珠；普通生长的或在 4 度保存的菌，接种时可以取 5 至 10ml 加入含有 50 mL 7H9(含 0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中。2) 检测菌液的 OD 值，若达到 0.5-1.2，则可进行电转化。3) 配制 10% 甘油+0.05% Tween 80 并用 0.2m 滤器过滤。4) 将 40ml 菌液转至 50 mL 离心管中，加入 1013 颗玻璃珠后，于涡旋器中充分涡旋 5 分钟后目的是将菌团块打散，于离心机中 4000-8000rpm 离心 5 分钟。弃上清千
4、万小心，菌块很容易脱落。5) 加入 40mL 10%甘油，于涡旋器中充分洗涤细菌后，于离心机中以 4000-8000rpm 离心 5 分钟，弃上清千万小心，菌块很容易脱落。6) 重复步骤 5）1-2 次后，留约 1 mL 上清视菌浓度而定，一般较稠，似大肠杆菌感受态细胞密度，用带滤芯的枪尖，吹吸均匀后，室温静置。千万注意：枪杆不要碰到管壁。7) 于标记好的 0.2cm 的电转杯中，分别加入 10 L 浓缩后的质粒 DNA 和200 L 分枝杆菌感受态细胞。轻柔吹吸混匀后，于 37 度孵育至少 10 分钟，以利 DNA 吸附于细菌。8) 用 Bio-rad GenePulser 点转移，以电压
5、2.5KV、电阻 1000 、电容25F 脉冲波进行电转化。未加 DNA 的细菌阴性对照的脉冲时间应于1921 秒间，该时间范围显示待转细菌处于良好状态。若感受态细胞洗得不干净或质粒含盐较多，会发生爆炸，不过很多情况下，爆炸后的也可以长出阳性克隆。 未发生爆炸的电转杯灭菌后仍然可用。9) 迅速用带滤芯的枪尖于电转液中加入 2 mL 7H9(含吐温 80)培养基(先用1 mL 转移电转液，再用 1 mL 洗涤电转杯)，转移至 50mL 离心管中。千万注意：枪杆不要碰到管壁。 10)于 37 度孵箱中孵育 1220 小时，充分复活细菌并使其抗性表达。11)用带滤芯的枪尖吹吸混匀后，1ml/1.5m
6、l tube 分装，10000 rpm 离心 1分钟沉淀转化菌，弃上清，用 0.6 mL 7H9 培养基重悬后，以 500 L/板铺于 7H11(含 4-anti*及相应抗生素)培养板中。同时稀释一百倍后，500 L/板铺板。 可以尝试 制备的感受态于-80 保存，过几周后进行转化3实验12)避光，于 37 度孵箱培养培养时，2 个平板放在一个塑料袋中。避免多个放在一起，造成连环污染。 13)每周观察污染情况，第一周后，平板倒置。观察时，不要打开塑料袋。第 4 周可以判断转化是否成功。注意：离心要配平。备注 1:4-anti 抗生素:多粘菌素 B、放线菌酮、羧苄西林及甲氧苄啶，终浓度分别为 2
7、00、50、50 及 20g/mL)。 培养 BCG，H37Rv and H37Ra 的 7H9 可以加:4-anti 抗生素。4快速生长型电转程序：1. 需要准备的材料：1) 10% 甘油+0.05% Tween 80 20ml 甘油+180 毫升水+100ul Tween 80，并用 0.2m 滤器过滤。要求新鲜配制，不得超过 1 周2) 灭菌的玻璃珠，50ml 离心管，Bio-rad 于 0.2cm 的电转杯，25-ml移液管。3) 50ml 长好的对数期的菌液菌液的 OD 值，达到 0.6-1.3。带滤芯的 1ml 枪尖。3. 程序：1) 将待转菌接种至含有 50 mL 7H9(含 0
8、.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，37 度摇菌扩增。冻存甘油菌需要先加到含有 5ml 培养基的 50ml 离心管复壮，待长起之后，需取2ml，接种到含有 50 mL 7H9(含 0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中；菌落需取很多加入含有 50 mL 7H9(含 0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，同时锥形瓶中需加入 10 颗左右的玻璃珠；普通生长的或在 4 度保存的菌，接种时可以取 1 至 5ml 加入含有 50 mL 7H9(含 0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中。14)检测菌液的 OD 值，若达到 0.6-1.3，则可进行电转化
9、。15)配制 10% 甘油+0.05% Tween 80 并用 0.2m 滤器过滤, 置于冰中。16)将 40ml 菌液转至 50 mL 离心管中，加入 1013 颗玻璃珠后，于涡旋器中充分涡旋 5 分钟后目的是将菌团块打散，于 4 度离心机中 4000-8000rpm 离心 5-10 分钟。弃上清千万小心，菌块很容易脱落。17)加入 40mL 10%甘油，于涡旋器中充分洗涤细菌后，于 4 度离心机中以4000-8000rpm 离心 5 分钟，弃上清千万小心，菌块很容易脱落。18)重复步骤 5）1-2 次后，留约 1 mL 上清视菌浓度而定，一般较稠，似大肠杆菌感受态细胞密度，用带滤芯的枪尖，
10、吹吸充分混匀后于冰上放置。千万注意：枪杆不要碰到管壁。19)于标记好的 0.2cm 的电转杯中，分别加入 10 L 浓缩后的质粒 DNA 和200 L 分枝杆菌感受态细胞。轻柔吹吸充分混匀后于冰上放置 10 分钟。5加入电转仪前擦尽电转杯上的水分，20)用 Bio-rad GenePulser 点转移，以电压 2.5KV、电阻 1000 、电容25F 脉冲波进行电转化。未加 DNA 的细菌阴性对照的脉冲时间应于1921 秒间，该时间范围显示待转细菌处于良好状态。若感受态细胞洗得不干净或质粒含盐较多，会发生爆炸，不过很多情况下，爆炸后的也可以长出阳性克隆。 未发生爆炸的电转杯灭菌后仍然可用。21
11、)迅速用带滤芯的枪尖于电转液中加入 2 mL 7H9(含吐温 80)培养基(先用1 mL 转移电转液，再用 1 mL 洗涤电转杯)，转移至 50mL 离心管中。千万注意：枪杆不要碰到管壁。 22)于 37 度孵箱中孵育 412 小时，充分复活细菌并使其抗性表达。23)用带滤芯的枪尖吹吸混匀后，1ml/1.5ml tube 分装，10000 rpm 离心 1分钟沉淀转化菌，弃上清，用 0.6 mL 7H9 培养基重悬后，以 500 L/板铺于 7H11(不含 4-anti*)含相应抗生素40ug/ml HYG or 25ug/ml KAN培养板中。同时稀释一百倍后，500 L/板铺板。 可以尝试 制备的感受态于-80 保存，过几周后进行转化实验24)避光于 37 度孵箱培养。培养时，2 个平板放在一个塑料袋中。避免多个放在一起，造成连环污染。 备注 *:待转菌为 M.smegmatis 时，所用到的试剂及耗材均需于 4 度预冷，电转全过程需冰浴中完成。注意： 培养 M.smegmatis 的 7H9 /7H11 可以加: 放线菌酮，羧苄青霉素，4-anti 中的其它两种可能不耐。
