1、腺病毒介导存活素 RNA 干涉对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用作者：谢富华,王润秀,李莉萍，覃燕梅，梁念慈【摘要】 目的： 研究腺病毒介导的 RNA 干涉（RNA interference, RNAi）沉默存活素（Survivin）表达后， 对 MCF7细胞裸鼠人乳腺癌移植瘤的抑制作用. 方法： 构建携带 survivin shRNA 表达质粒的腺病毒 Adsurvivin，并检测其滴度；建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型；将重组腺病毒悬液行瘤周和瘤体注射，观察肿瘤生长情况；剥离瘤体称重并计算药物的抑瘤率；免疫组织化学检测 Survivin 蛋白表达情况. 结果： 成功建立人乳腺癌肿瘤模型，移植瘤成功率
2、为 90%（18/20）；给药后实验组移植瘤的生长速度慢于对照组；病理学检查为浸润性导管癌；剥离肿瘤组织称重发现实验组抑瘤率为 28.89%（P0.05）；免疫组化发现实验组 Survivin 蛋白表达区的吸光度值为（15.631.54），明显低于阴性对照组（30.456.72 ）和空白对照 组（30.256.58 ），差异均有统计学意义（P0.05）. 结论： 以腺病毒为载体，以 survivin 基因为靶点 RNAi 介导的基因治疗方法有望成为乳腺癌一种新的治疗策略. 【关键词】 RNA 干扰; 存活素（survivin）; 重组腺病毒；裸鼠；基因治疗0 引言存活素（Survivin）作为
3、一种凋亡抑制蛋白，通过多条细胞信号传导通路抑制细胞凋亡，除了 Wnt，FOXM1 等通路可能参与乳腺癌Survivin 蛋白的调控外1-2，尚有许多细胞因子如VEGF，p27，Stat5等也与 Survivin 蛋白相关3-5 . 目前，应用 RNA干扰技术、核酶技术、反义核苷酸技术等进行的靶向 survivin 基因治疗研究，大多为体外实验，而在体内对肿瘤的生长抑制作用的研究还少见报道. 本研究在建立乳腺癌动物模型的基础上，以 Survivin 蛋白为靶点，通过 RNAi 技术和重组腺病毒技术，对乳腺癌的基因治疗进行体内研究，以期通过观察肿瘤生长抑制情况，探索肿瘤基因治疗的新途径，为实现抗乳
4、腺癌生长与转移提供理论依据.1 材料和方法1.1 材料 Blal/bnu/nu雌性裸小鼠 20 只，46 wk 龄，体质量1722 g（广东医学院实验动物中心；MCF7 细胞（广东医学院分子生物学实验室保存）；HEK293 细胞（中国科学院上海细胞研究所）；胎牛血清（杭州四季青公司）；RPMI 1640 培养液（美国 Gibeo 公司）；腺病毒包装试剂盒（美国 ambion 公司）；小剂 量腺病毒纯化试剂盒（广州展晨生物技术有限公司）；免疫组织化学检测试剂盒，Survivin mAb（北京中杉金桥生物技术有限公司）.1.2 方法1.2.1 重组腺病毒的构建与纯化将前期实验中构建的 surviv
5、in shRNA 表达质粒和阴性对照质粒，按 pSilencer adeno 1.0CMV试剂盒与腺病毒纯化试剂盒说明书构建并纯化重组腺病毒,分别命名为Adsurvivin和 Adcontrol.1.2.2 重组腺病毒滴度测定采用文献6的微量全细胞病变法检测病毒滴度. 取 96 孔板，每孔加入 1104 HEK293细胞，加培养液200 L，置孵箱培养 24 h. 待测病毒用 DMEM 全培养基稀释至 10-2，10-3，10-4，10-5，10-6 及 10-7 的稀释度病毒液体，吸去上清后，分别加入每个稀释度的病毒液体，每孔 200 L，每孔均设复孔，同时设培养基对照(不含腺病毒). 37
6、，50 mL/L CO2 条件下继续培养3648 h. 镜下观察完全细胞病变现象，按以下公式计算滴度. 滴度（pfu/mL）=（接种细胞数稀释度10）/加入的病毒体 积（mL ）.1.2.3 人乳腺癌模型的建立按照文献7的方法，将 MCF7细胞0.1 mL(1101051010 细胞/L)接种于裸鼠右前肢腋下，待瘤径达0.5 cm 左右时随机分组，每组 6 只. 瘤内及瘤周同时注射 0.1 mL Adsurvivin，Adcontrol或 PBS参照文献8-9的方法，病毒量为1108 pfu/（只次），1 次/3 d，共 9 次. 用游 标卡尺测量瘤体长径（a）和短径(b) ，按公式计算移植瘤
7、体积. 移植瘤体积（V ，mm3）=ab2/6计算，观察 3 wk，绘制生 长曲线.1.2.4 标本采集及瘤组织病理学观察药物处理结束后 3 d，脱颈椎处死裸鼠，剥出肿块称重，参照文献10-11的方法，按公式 计算抑瘤率. 抑瘤率（%）=（1-实验组瘤重/对照组瘤重）100%. 切取肿瘤、肺脏和肝脏组织制备组织切片，HE 染色后采用光镜观 察并分析.1.2.5 免役组织化学检测按 SP 法要求，对肿 瘤组织中 Survivin 蛋白的表达情况进行检测. 结果判断标准：以染成棕黄色或棕褐色为阳性细胞，并通过 Motic 医学图像分析系统比较三组图片中棕黄色或棕褐色区域的累积吸光度值（每组各选 1
8、0 视野分析）.统计学处理：采用 SAS8.1 统计软件进行 统计学分析，实验结果以xs 表示，采用完全随机设计方差分析，比较各组肿瘤重量及免疫组化结果. P0.05 为差异具有统计学意义.2 结果2.1 重组腺病毒的滴度接种腺病毒后 3648 h，观察到在 10-2，10-3，10-4 稀释度的样本中 293 细胞出现完全细 胞病变现象，如：细胞变圆变大，帖壁能力降低，并聚集成葡萄状等，以最低稀释度（10-4 ）代入公式中计算，腺病毒滴度约为 5109 pfu/mL.2.2 移植瘤生长情况接种乳腺癌 MCF7细胞株后 11 d，于接种处可见微小突起，以后逐渐明显. 接种后 17 d，有 18
9、 只裸鼠移植瘤体积均超过 100 mm3，接种成功率为 90%. 接种后 17，20，23，26 d，Adsurvivin组的移植瘤体积与 Adcontrol组和 PBS 组的无明显区别. 接种后 29 d，Adsurvivin组的移植瘤体积（210.594.25） mm3小于 Adcontrol组（365.0414.13 ） mm3 和 PBS 组（412.28.90） mm3，但三 组间的差异无 统计学意义（P0.05）. 接种后 32 d，Adsurvivin组的移植瘤体积（288.025.22） mm3 明显小于Adcontrol组（516.0811.79 ） mm3 和 PBS 组（
10、625.2550.95） mm3，差异均有统计学意义（P0.05，图 1）.图 1 给药后各组肿瘤生长曲线2.3 移植瘤组织病理学观察移植瘤呈椭圆形或分叶状生长（图 2），质地硬，切面灰白. 光镜下可见移植瘤细胞形状不规则，大小不均一，核大浓染，核异形性明显，有病理性核分裂像，核浆比例明显增大. 各组裸鼠的肝、肺脏组织未见损伤和瘤细胞转移（图 3）.2.4siRNA 药物的抑瘤作用接种后 35 d 处死裸鼠，剥离瘤体称重发现：Adsurvivin 组瘤体质量为（0.320.04） g，低于 PBS 组（0.450.06） g 和 Adcontrol组（0.410.06） g，其差异具有统计学意
11、义（P0.05），表明 Adsurvivin组肿瘤细 胞增殖受到抑制，抑制率为 28.89%；而 Adcontrol组和 PBS 组间的差异无统计学意义（P0.05）.2.5 移植瘤组织 Survivin 蛋白表达免疫组化结果显示（图 4），Survivin 抗原表达于移植瘤细胞质内，阳性细胞呈棕黄色或棕褐色. Motic 医学图像分析各 组棕黄色或棕褐色区域的累 积吸光度值，Adsurvivin组为（15.631.54），低于 PBS 组（30.456.72）和Adcontrol组（30.246.58 ），其差异具有统计学意义（P0.05）. 表明 Adsurvivin组肿瘤细胞中 Surv
12、ivin 蛋白表达受到抑制；而Adcontrol组和 PBS 组间的差异无统计学意义（P0.05 ）.3 讨论Survivin 蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，能抑制 caspase 活性而 发挥抗凋亡作用. 以 survivin 基因为靶点的 RNAi 研究最早报道于 2003 年，Carvalho 等12用 siRNA 转染HeLa 细胞，60 h 后采用 Western Blot 检测不到 Survivin 蛋白的表达，细胞增殖明显受到抑制，部分细胞出现凋亡. 随着 RNAi 技术的不断完善，由原来直接
13、导入外源的 siRNA，发展到真核表达载体转录产生siRNA，以及用于 RNAi 的病毒载体的出现，大大提高了转染效率和干扰效率. Cheng 等13用针对 survivin 基因的 RNAi 真核表达载体转染肝细胞癌 SMMC7721细胞，发现转染细胞中几乎没有 survivin基因的表达，转染细胞自发的凋亡增加，G2/M 期细胞比例减少，细胞增殖减慢. 如今针对 survivin 基因的 RNAi 研究进展迅速，体外实验显示了良好的效果，但体内研究的报道尚不多见.本研究选用 BALB/C 遗传背景的裸鼠作为体内移植肿瘤的动物模型，成瘤后见肿瘤细胞呈条索状生长，细胞形状不规则，大小不均一，核
14、大浓染，核异形性明显，可见病理性核分裂像，核浆比例明显增大，表明所建立的动物模型符合实验要求. 然后应用腺病毒介导的 RNAi 技术对瘤体及瘤周进行注射观察其抑瘤效果. 结果发现实验组肿瘤的生长速度、体积均慢于或低于对照组. 表明经过 RNAi 封闭后，survivin 基因的表达受到抑制，细胞分泌 Survivin 蛋白的量明显减小，从而减缓或解除了其抑制凋亡的作用，诱导了大量肿瘤细胞凋亡并抑制了肿瘤细胞的增殖活性. 然而，本 实验应用 RNAi 对在体肿瘤的抑制率并不很高，原因除了实验过程中的影响因素外，还有肿瘤的发生发展是一个全身的、多因素的、多基因参与的复杂过程，针对单一基因的 RNA
15、i 可能对有的肿瘤其抑制效果不很明显，若结合放疗或化疗以及联合其他基因进行治疗，则效果可能会更好.【参考文献】1 Sakoguchi N, Takahashi F, Fukada K, et al. Celecoxib inhibits the expression of survivin via the suppression of promoter activity in human colon cancer cellsJ. Biochem Pharmacol, 2007,73(9):1318-1329.2 Okinaka K, Satoki N, Hirano I, et al. Ele
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